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一、前言

分光光度计是现代光谱分析中应用最为广泛的仪器之一。
它通过测量物质对不同波长光的吸收程度，实现对物质浓度、组成和结构特征的定性与定量分析。
赛默飞 Evolution 系列分光光度计以高光学精度、稳定性和智能化操作著称，涵盖从教学型到科研级的多个型号，如 Evolution 60S、Evolution 201、Evolution 220、Evolution One 与 Evolution One Plus。

仪器测量原理的理解，是正确使用与维护的前提。
本文将系统阐述 Evolution 系列分光光度计的测量原理，包括光谱吸收理论、光路构成、信号转换机制及误差控制技术，帮助操作者全面掌握其科学基础与应用方法。

二、分光光度测量的理论基础

1. 光的吸收与透射

当一束单色光通过均匀溶液时，光能部分被吸收、部分透过。
假设入射光强为 I0I_0I0，透射光强为 $I$，两者关系遵循 Lambert–Beer 定律：

A=log⁡10I0I=εclA = \log_{10}\frac{I_0}{I} = \varepsilon c lA=log10II0=εcl

式中：

• $A$：吸光度（Absorbance）；

• $\epsilon$：摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）；

• $c$：溶液浓度（mol·L⁻¹）；

• $l$：光程长度（cm）。

该公式表明：吸光度与浓度和光程成正比，与入射光强无关。

2. 吸光度与透过率关系

透过率定义为：

T=II0T = \frac{I}{I_0}T=I0I

吸光度与透过率的关系为：

A=−log⁡10(T)=2−log⁡10(%T)A = -\log_{10}(T) = 2 - \log_{10}(\%T)A=−log10(T)=2−log10(%T)

由此可见，吸光度的变化反映了样品对特定波长光的吸收能力，是定量分析的核心参数。

3. 定量分析意义

在 Beer 定律成立的范围内（通常为 0.1–1.0 A），吸光度与浓度呈线性关系。
因此，测定吸光度即可推算溶液中待测物质浓度，实现精确的定量分析。

三、Evolution 系列光学系统原理

Evolution 系列分光光度计的核心是其 光学分光与检测系统。
仪器通过将白光分解为单色光，再测量样品对该波长光的透射强度，从而计算吸光度。

1. 光源系统

仪器采用 氘灯（Deuterium Lamp） 与 钨卤素灯（Tungsten-Halogen Lamp） 组合光源：

• 氘灯：发射 190–350 nm 的紫外光，适合核酸、蛋白质、无机离子分析；

• 钨卤素灯：发射 350–1100 nm 的可见光与近红外光，适用于有机化合物、颜料及材料分析。

系统自动根据波长切换光源，切换区间一般位于 340–370 nm，确保能量平滑过渡。

2. 入射光路与准直

光源发出的多色光首先经过 准直透镜 或 反射镜系统 调整为平行光。
随后光束通过 入射狭缝（Entrance Slit） 限制光宽，保证入射光束单一方向并减小杂散光。

3. 单色器系统

单色器是实现分光的关键部件。
Evolution 系列采用 全反射光栅型 Czerny-Turner 单色器，通过光栅的衍射效应将复合光分解为单一波长光。

主要结构：

• 两个反射镜用于聚焦与成像；

• 光栅实现色散作用；

• 出射狭缝控制波长带宽。

波长选择由步进电机驱动光栅旋转实现，波长精度可达 ±0.3 nm。

4. 样品舱与比色皿

单色光经出射狭缝后进入样品舱，通过放置于光路中的比色皿。
比色皿中装有待测溶液，光在其中部分被吸收，剩余透射光到达检测器。
仪器同时记录空白溶液与样品溶液的透射光强度，以计算吸光度差值。

5. 检测器系统

Evolution 系列根据型号配置两种检测器：

• 硅光二极管（Si Photodiode）：响应速度快，噪声低；

• 光电倍增管（PMT）：灵敏度高，适用于低浓度检测。

检测器将透射光能量转换为电信号，经放大、A/D 转换后由主控系统计算吸光度。

四、测量信号的获取与处理

1. 光电转换原理

检测器输出电流信号与入射光强度成正比：

$$I=k\cdot P$$

其中 $I$ 为输出电流，$P$ 为光强，$k$ 为响应系数。
仪器通过测量空白（I0I_0I0）与样品（$I$）信号强度，计算透过率与吸光度。

2. 模拟信号与数字信号转换

模拟信号经低噪声放大器处理后，进入高精度 A/D 转换模块（24 位分辨率）。
数字信号再由软件进行基线修正、漂移补偿与数据平均，最终输出稳定的吸光度结果。

3. 自动增益与能量补偿

Evolution 系列采用 自动增益控制（AGC） 技术，在不同光强下动态调整放大倍率，保持信号线性。
同时，系统具备 光源能量自校正功能，实时检测灯源能量变化并自动补偿，确保长期测量稳定。

五、测量模式的原理差异

1. 固定波长测量

仪器在设定波长处测量样品吸光度或透过率，常用于单组分定量分析。
结果计算公式：

A=log⁡10I0IA = \log_{10}\frac{I_0}{I}A=log10II0

适用于蛋白质定量、核酸浓度检测、药物溶液分析等。

2. 波长扫描模式

仪器在设定波段范围内连续改变光栅角度，记录吸光度随波长变化的曲线。
该模式用于确定最大吸收峰（λmax）及光谱特征分析。

3. 时间扫描模式

保持波长不变，记录吸光度随时间变化曲线，用于反应动力学研究。
软件自动拟合反应速率常数或半衰期。

4. 定量分析模式

通过测定不同浓度标准溶液的吸光度，建立标准曲线：

$$A=kC+b$$

将未知样品吸光度代入计算浓度，实现浓度定量。

5. 多波长测量

在多个特征波长上同步测量吸光度，适用于多组分样品的分光分析。

六、仪器性能优化机制

1. 自动基线校正

仪器在测量前自动执行“Baseline Correction”，通过记录空白样品信号消除光源与环境背景干扰。

2. 杂散光抑制技术

Evolution 系列通过多级反射结构与防反射涂层设计，显著降低杂散光水平至 ≤0.05%T。
此外，样品舱内壁采用黑化消光处理，避免光线反射干扰。

3. 光源稳定控制

内置稳压电源与热平衡系统，维持氘灯与钨灯恒定电流输出；
温度传感器实时反馈控制灯源功率，防止热漂移。

4. 温度补偿算法

检测器信号会随温度变化略有波动。
Evolution 软件自动读取环境温度并修正信号响应，确保吸光度不随温度变化。

七、信号线性与校准原理

1. 吸光度线性关系

在 Beer 定律成立条件下，吸光度与浓度的线性关系可表示为：

$$A=\epsilon cl$$

当样品浓度过高时，光吸收趋于饱和，线性关系将偏离。
因此实验中应将吸光度控制在 0.2–1.0 A 范围内，以保证准确性。

2. 波长校准原理

仪器内置氧化钬滤光片，通过识别其特征吸收峰位置（如 361.5 nm、536.3 nm），修正光栅角度与波长定位。

3. 吸光度校准原理

使用重铬酸钾标准溶液，在 235、257、313、350 nm 处测量吸光度，以验证吸光度准确性。
偏差应不超过 ±0.005A。

八、信号噪声与误差控制

1. 随机噪声

由检测器热噪声、电路波动等引起。
通过信号平均与积分时间优化可有效降低。

2. 系统误差

来源于光源衰减、比色皿光程偏差、波长不准等。
定期执行光源能量测试与波长验证可修正误差。

3. 操作误差

样品未充分混匀或比色皿方向不一致会引起吸光度差异。
实验中应保持操作一致性并严格按照 SOP 执行。

九、典型测量流程解析

以核酸浓度测定为例说明：

1. 选择波长 260 nm 进行测量；

2. 以纯水为空白进行基线校正；

3. 测量样品吸光度 A260A_{260}A260；

4. 计算浓度：

   DNA 浓度（μg/mL）=A260×50\text{DNA 浓度（μg/mL）} = A_{260} \times 50DNA 浓度（μg/mL）=A260×50RNA 浓度（μg/mL）=A260×40\text{RNA 浓度（μg/mL）} = A_{260} \times 40RNA 浓度（μg/mL）=A260×40

5. 计算纯度比值：

   A260/A280\text{A}_{260}/\text{A}_{280}A260/A280

   若比值为 1.8–2.0，则表明样品纯度高。

此过程体现了 Evolution 系列在紫外区高灵敏测量的稳定性与准确性。

十、扩展测量原理

1. 差分吸收法

用于检测化学反应过程中细微吸光变化，通过比较样品与参比吸收差异，放大分析灵敏度。

2. 动态光谱法

结合时间扫描模式，实时监测反应速率，自动生成动力学曲线。

3. 比率测定法

利用双波长比率消除样品浊度或背景影响，适合复杂体系分析。

4. 衍射与反射模式

配合积分球附件可测定固体材料的反射光谱，实现表面光学特性研究。

十一、Evolution 系列测量原理优势

1. 全波段覆盖：190–1100 nm 范围内连续测量；

2. 双光源设计：确保能量平滑过渡与高信噪比；

3. 高精度波长控制：步进电机驱动光栅定位；

4. 自动化数据校正：消除基线漂移与能量衰减；

5. 多模式测量：兼容定性、定量及动力学研究；

6. 宽动态范围检测：吸光度范围 0–4 A，覆盖低高浓度样品。

这些特性使其成为科研实验室和工业检测机构的重要光谱分析平台。