赛默飞分光光度计Evolution样品准备
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一、前言
在分光光度分析中，样品的准备过程直接影响实验结果的准确性与可重复性。
赛默飞 Evolution 系列分光光度计凭借高分辨率光学系统和智能化软件平台，为科研与检测提供了优越的测量精度。
然而，即便仪器性能再稳定，若样品处理不当，也会导致吸光度偏差、光谱失真或结果波动。
因此，掌握正确的样品前处理与比色皿操作规范，是确保测量结果可靠的关键。
本文将从样品制备原则、溶液配制、浓度选择、光程控制、温度影响、清洁管理与误差防范等方面进行详细说明，帮助实验人员建立规范化操作流程。
二、样品准备的重要性
样品的状态和质量决定了光谱信号的真实性。
Evolution 系列采用双光源系统（氘灯与钨卤素灯），对光的吸收极为敏感，任何杂质、气泡或浓度偏差都可能引起误差。
良好的样品准备应满足以下条件：
样品成分明确、均匀无气泡；
溶液澄清透明，无悬浮颗粒；
浓度适中，吸光度值处于 0.2–1.0 A 范围；
样品与空白溶液组成相同溶剂体系；
温度与环境条件稳定；
比色皿干净、光程一致。
三、样品类型与适用分析
Evolution 系列分光光度计适用于多种样品形态：
| 样品类型 | 特点 | 典型应用 |
|---|---|---|
| 液体溶液 | 最常见，易配制 | 化学反应动力学、有机物浓度测定 |
| 固体溶液或溶胶 | 需溶解或分散 | 药物片剂溶解度、粉末样品分析 |
| 悬浊液 | 可测散射或透射率 | 纳米颗粒溶液、乳液研究 |
| 生物样品 | 含蛋白质或核酸 | DNA/RNA 定量、酶活性测定 |
不同样品类型对应不同的前处理方法，以下章节分别阐述。
四、溶液样品的准备流程
1. 试剂与溶剂选择
使用分析纯或光谱纯试剂；
溶剂应具备高透光性（如蒸馏水、乙醇、丙酮等）；
避免使用含杂质的缓冲液或不透明溶剂。
溶剂的吸收特性决定空白基线稳定性，因此应保证溶剂在测量波长范围内无明显吸收。
2. 溶液配制步骤
按照实验要求准确称量样品；
用适当溶剂溶解并定容；
使用磁力搅拌器混合均匀；
必要时过滤（0.45 μm 滤膜）或离心以除去悬浮颗粒。
3. 浓度范围控制
过高的样品浓度会导致吸光度超过线性范围，引发偏差。
建议吸光度范围控制在 0.2–1.0 A。
若浓度过高，应按比例稀释，并保持溶剂比例一致。
4. 稀释注意事项
使用相同批次溶剂进行稀释；
使用量程合适的移液管与容量瓶；
混匀后立即测量，避免成分沉降或挥发。
五、生物样品的准备
1. 核酸与蛋白质样品
在核酸和蛋白质测定中，样品纯度直接影响吸收峰形与 A260/A280 比值。
（1）样品要求
DNA/RNA 应溶于 TE 缓冲液或去离子水；
蛋白质样品可使用 PBS 缓冲液或专用检测溶液；
样品必须澄清透明，无杂质沉淀。
（2）浓度控制
核酸样品：A260 应在 0.05–1.0 范围；
蛋白样品：A280 建议小于 1.5。
（3）储存条件
短期样品可在 4℃ 保存；
长期样品需冷冻并避免反复冻融。
2. 酶反应或动力学实验样品
酶活性测定要求时间响应快，因此样品需提前平衡温度，避免延迟反应。
建议：
在测量前预热样品至反应温度（如 37℃）；
使用恒温比色皿架以保持温度稳定；
启动测量前确保反应体系混匀。
六、固体与悬浊液样品的前处理
1. 固体样品
若样品为粉末或固态物质，应先溶解或制备成适宜的液态样品。
常用方法：
溶解法：使用适当溶剂（如酸、碱或有机溶剂）完全溶解；
浸提法：提取溶液中的活性成分；
分散法：采用超声波使固体均匀悬浮。
样品未完全溶解会导致光散射效应，从而影响吸光度稳定性。
2. 悬浊液与胶体样品
悬浊液需处理至均匀状态：
使用超声振荡 1–2 分钟；
避免过度搅拌以防颗粒破裂；
若测定散射光强，应在同一时间间隔内完成所有样品测量。
七、比色皿使用与管理
比色皿是光程控制与光线传输的重要组件。
1. 材质选择
| 材质 | 波长适用范围 | 应用场景 |
|---|---|---|
| 石英比色皿 | 190–900 nm | 紫外及可见光全波段 |
| 光学玻璃比色皿 | 350–900 nm | 可见光测定 |
| 塑料比色皿 | 400–800 nm | 一般教学或低精度测量 |
2. 使用规范
加样体积应占比色皿 2/3；
避免液面波动或气泡；
外壁保持干净无指纹；
比色皿放置方向保持一致（标记面向同一方向）。
3. 清洁与保养
使用后立即用蒸馏水冲洗；
避免使用强酸碱或磨损性清洁剂；
用无尘布擦干外表面；
定期检查透光率，发现划痕应及时更换。
八、空白溶液的制备与基线校正
空白溶液是建立零吸光度基线的参比。
1. 空白溶液原则
应与样品溶液除被测物外的所有组分完全一致；
使用相同溶剂、缓冲液与稀释比例；
若测定多组样品，应确保空白稳定一致。
2. 校正步骤
在系统中选择“Blank”模式；
将空白溶液装入比色皿并放入样品舱；
点击执行基线校正；
校正完成后取出空白比色皿并开始样品测量。
3. 注意事项
若光谱范围较宽（200–800 nm），可分区校正；
空白测定应在光源稳定后进行；
空白液体不得出现气泡或污染。
九、温度与环境控制
1. 温度影响
温度变化会导致吸光度漂移，尤其在生化反应或高精度测定中影响显著。
Evolution 系列可配合恒温比色皿架或外接恒温水浴使用。
建议：
环境温度控制在 20–25℃；
样品测量前静置 3–5 分钟以达到温度平衡；
测量过程中避免阳光直射。
2. 环境要求
室内相对湿度 40%–70%；
避免强磁场与电源干扰；
仪器台面应平稳、防震、防尘。
十、样品稳定性与储存
1. 短期稳定性
测量前确保样品处于化学稳定状态；
若样品可能氧化或分解，应在制备后立即测量；
避免挥发性溶剂样品长时间暴露。
2. 长期储存
样品存放容器应为惰性材料，如玻璃或聚四氟乙烯；
储存温度与光照条件根据样品性质确定；
标明样品编号、日期与浓度。
十一、样品误差来源与控制措施
| 误差来源 | 影响 | 控制措施 |
|---|---|---|
| 样品浓度不均 | 吸光度波动 | 充分搅拌或超声均化 |
| 比色皿污染 | 光散射增加 | 清洁并检查透光率 |
| 气泡 | 吸光度异常高 | 用吸管轻拍比色皿壁除泡 |
| 溶剂吸收干扰 | 基线偏移 | 选择透明度高的溶剂 |
| 温度变化 | 吸收系数变化 | 保持恒温条件 |
| 样品老化 | 吸收峰漂移 | 使用新鲜溶液 |
十二、样品编号与记录规范
每个样品应具有唯一编号，便于追踪与数据分析。
记录内容包括：
样品编号与名称；
配制日期与操作者；
溶剂种类与配比；
稀释倍数与浓度；
备注说明（如温度、pH、保存条件）。
这些信息可直接导入 Evolution 软件中，自动生成实验报告。
十三、样品准备实例
实验示例：重铬酸钾标准溶液吸收测定
精确称取 0.0600 g 重铬酸钾（K₂Cr₂O₇），溶于 1000 mL 蒸馏水中；
配制浓度 60 mg/L 的标准溶液；
稀释 2 倍、4 倍、8 倍制成系列溶液；
以蒸馏水为空白，执行基线校正；
选择 257 nm 波长测量吸光度；
记录吸光度值并绘制标准曲线。
通过此规范流程，所得吸光度数据线性良好，R² ≥ 0.999。
十四、样品准备与仪器性能匹配
良好的样品准备应与仪器性能相匹配：
对高浓度样品，可启用自动衰减功能以防光电饱和；
对低吸收样品，可调整带宽提升信噪比；
对粘稠溶液，应延长信号积分时间以稳定读数。
通过合理的样品处理，可充分发挥 Evolution 系列高灵敏度和宽动态范围的优势。
