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一、概述

赛默飞 Evolution 系列分光光度计 是一类高精度的紫外–可见光光谱仪器，其核心性能取决于波长控制的准确度与稳定性。
在分光光度测定中，不同波长对应不同能量的光子，物质对光的吸收具有选择性，因此波长的设定与校正直接决定测量结果的可靠性。

“波长调整”（Wavelength Adjustment）不仅包括设定目标波长用于测量，还涵盖光学系统校准、光栅定位、波长线性检查与漂移修正等环节。
Evolution 系列配备了高精度步进电机与光栅控制系统，可实现 0.1 nm 级的波长定位精度。

本文将从理论原理、操作流程到实际应用，系统阐述波长调整的全过程。

二、波长调整的理论基础

2.1 光的波长与能量

波长（λ）表示电磁波中相邻两个波峰之间的距离，单位通常为纳米（nm）。
光的能量与波长关系如下：

E=hcλE = \frac{hc}{\lambda}E=λhc

其中：

• h 为普朗克常数；

• c 为光速。

波长越短，光能量越高。紫外光区（190–350 nm）能量强，适合检测核酸、蛋白质及无机离子；可见光区（350–800 nm）用于显色反应与比色分析；近红外区（800–1100 nm）多用于材料透射测试。

2.2 波长选择的意义

不同物质具有特征吸收波长。通过选择合适的波长，仪器可最大程度增强灵敏度和选择性。例如：

• 核酸：260 nm；

• 蛋白质：280 nm；

• Fe³⁺–SCN⁻ 配合物：480 nm；

• 染料溶液：500–600 nm。

因此，波长调整的准确性直接影响吸光度测量值与样品浓度计算的精度。

三、Evolution 波长控制系统结构

3.1 光源模块

Evolution 系列采用双光源系统：

• 氘灯（Deuterium Lamp）：用于紫外区域（190–360 nm）；

• 钨卤灯（Tungsten-Halogen Lamp）：用于可见至近红外区域（320–1100 nm）。

仪器根据设定波长自动切换光源，以保证最佳信号强度与稳定性。

3.2 分光系统

分光器是波长控制的核心，由准直镜、入射狭缝、全息光栅和出射狭缝组成。
光栅利用衍射原理将复合光分解为不同波长单色光。
光栅转动角度决定输出波长，角度变化与波长满足公式：

d(sin⁡i+sin⁡θ)=nλd(\sin i + \sin \theta) = n\lambdad(sini+sinθ)=nλ

Evolution 通过高精度步进电机调节光栅角度，实现 nm 级波长定位。

3.3 光学检测系统

单色光经样品后到达检测器（硅光二极管或光电倍增管），检测信号与光强相关。
仪器通过闭环控制实时反馈波长与信号匹配，确保输出稳定。

四、波长调整操作步骤

波长调整分为“测定波长设置”和“波长校准”两类操作。前者用于实验测定，后者用于仪器精度维护。

4.1 实验测定波长设置

（1）固定波长设定

1. 打开仪器电源并启动软件；

2. 选择“Fixed Wavelength”模式；

3. 在输入框中键入目标波长（如 260 nm、595 nm 等）；

4. 确认测量单位（A 或 %T）；

5. 点击“Apply”，仪器自动调节光栅并锁定波长。

注意事项：

• 若样品波长未知，应先进行光谱扫描；

• 测定时保持样品与空白条件一致；

• 确认光源切换区间无异常闪烁。

（2）光谱扫描波长区间设定

1. 选择“Scan Mode”；

2. 设置起始波长与终止波长（如 200–800 nm）；

3. 设置步长（如 1 nm）与扫描速度（600 nm/min）；

4. 执行空白校正后点击“Start”；

5. 仪器自动逐步调整波长并记录吸光度。

此过程称为“自动波长扫描”，每个波长点对应一组数据，绘制完整吸收光谱曲线。

（3）多波长设定

在多组分测定中，可一次设定多个波长：

• 选择“Multi-Wavelength Mode”；

• 输入各测定波长（如 340 nm、400 nm、600 nm）；

• 仪器依次调整波长并自动记录结果。

这种方法常用于多物质共存体系的差谱分析。

4.2 仪器波长校准

波长校准用于确保仪器输出的光谱位置与实际波长一致。

（1）校准原理

校准通过测定标准物质（如氧化钬滤片或汞灯）在特定波长处的吸收峰，与理论值比较并修正偏差。

（2）常用标准物质

• 氧化钬（Holmium oxide）滤片：具有多个稳定吸收峰（241.5 nm、279.4 nm、287.6 nm、361.5 nm、536.3 nm、638.3 nm 等）；

• 汞灯（Hg lamp）：发射特征谱线（253.7 nm、365.0 nm、404.7 nm、546.1 nm）。

（3）校准步骤

1. 打开软件，选择“Wavelength Calibration”程序；

2. 插入标准滤片或点亮汞灯；

3. 仪器扫描并检测特征峰位置；

4. 系统自动计算峰值与标准值差异 Δλ；

5. 若偏差超过允许范围（±0.3 nm），执行自动修正；

6. 保存校准结果并生成报告。

校准完成后，仪器波长误差恢复到规范标准。

五、波长漂移与修正

5.1 波长漂移定义

波长漂移是指仪器在长期使用中，光栅角度或光源位置发生微小变化，导致输出波长与理论值偏离。

5.2 主要原因

1. 光栅磨损或安装应力；

2. 光源老化、灯丝位置偏移；

3. 温度变化引起机械膨胀；

4. 电机步进误差累积；

5. 电子信号基准漂移。

5.3 修正措施

• 执行周期性波长校准（建议每月一次）；

• 保持仪器环境温度稳定；

• 更换使用寿命接近上限的光源；

• 校准前确保光栅清洁、无灰尘。

六、波长调整的影响因素

1. 光源选择：
   在 300–360 nm 区间，氘灯与钨灯重叠，若切换点不当，可能引起信号跳变。应在软件中选择自动或手动切换方式。

2. 带宽设置：
   带宽过大可能导致相邻峰重叠，过小则降低光强。推荐 1–2 nm 以兼顾分辨率与信噪比。

3. 扫描速度：
   速度过快时波长定位精度下降。建议常规使用 600 nm/min。

4. 样品吸收强度：
   吸光度超过 2.0 A 时光强过低，会使波长拟合出现偏差，应稀释样品。

5. 环境温度与湿度：
   光学元件热膨胀或水汽附着会改变光路长度，从而影响波长精度。

七、波长验证与精度评估

7.1 验证频率

建议每月或在重大维护后执行一次波长验证，以确保测定精度。

7.2 验证标准

按国家计量规范要求，波长精度应满足：

• 紫外区（200–400 nm）：±0.3 nm；

• 可见区（400–800 nm）：±0.5 nm。

7.3 验证步骤

1. 插入氧化钬滤片；

2. 执行自动扫描；

3. 比较测得峰值与理论波长；

4. 若偏差超限，重新校准或维修。

7.4 结果判定

当所有特征峰偏差均在允许范围内，波长系统合格。

八、软件中的波长控制功能

Evolution 软件提供直观的波长调整界面，主要模块包括：

软件内置的智能算法能实时监控光栅角度反馈信号，确保波长定位与显示一致。

九、波长调整中的常见问题

十、波长调整的应用技巧

1. 先扫描后定点：
   对未知样品，先执行光谱扫描以确定 λmax，再在固定波长模式下进行定量测定。

2. 双波长法：
   对背景干扰较大的样品，可设两个波长（主波长 λ₁、参考波长 λ₂），计算 ΔA = A₁–A₂ 以抵消干扰。

3. 差谱分析：
   对反应过程样品在不同时间点测定光谱差异，观察峰位变化，可反映化学反应进程。

4. 温控辅助：
   对波长敏感的样品（如蛋白质或酶溶液），使用恒温比色皿架以保持光谱稳定。

5. 短期验证：
   在关键实验前，使用氧化钬滤片快速检测 546.1 nm 或 279.4 nm 峰位，确认波长无漂移。

十一、维护与保养建议

1. 每次使用前预热光源 10–15 分钟；

2. 定期清洁光栅与狭缝，防止灰尘散射；

3. 波长校准周期：正常使用每 1–2 个月一次；

4. 更换光源后必须重新执行波长校准；

5. 避免频繁开关电源，防止机械冲击。

十二、波长调整在实验中的实际应用

1. DNA/RNA 定量分析：波长设为 260 nm，评估核酸浓度与纯度；

2. 蛋白质检测：280 nm 吸收峰反映芳香族氨基酸含量；

3. 药物定量：根据化合物吸收峰设定波长，建立标准曲线；

4. 材料光学性能测试：扫描 200–900 nm 光谱，研究吸收边与带隙；

5. 环境样品测定：如水质中硝酸盐（220 nm 与 275 nm 双波长法）。

这些实验均依赖准确的波长调整以确保结果可信。

十三、波长精度对测定结果的影响

• 当波长误差为 ±1 nm 时，吸光度误差可能高达 1–3%；

• 若在陡峭吸收峰区域测定，偏差放大效应更明显；

• 对比色分析中，波长不准可能导致线性偏移，影响定量曲线斜率；

• 在动力学实验中，波长偏移可能改变速率曲线形态。

因此，波长精度是影响实验可信度的重要指标之一。

十四、波长调整的质量控制

1. 建立仪器日志：记录每次波长校准日期、偏差值与操作人；

2. 引入标准验证样：如氧化钬滤片、钕玻璃滤片等；

3. 实验复测：定期检测标准溶液（如 K₂Cr₂O₇），判断波长稳定性；

4. 长期监控：若连续两次偏差大于 0.5 nm，应进行专业维护。