赛默飞分光光度计Evolution参数设置
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一、概述
赛默飞 Evolution 系列分光光度计 是一款高精度紫外–可见光分析仪器，广泛应用于化学分析、生物定量、药物检测、环境监测与材料研究等领域。
其优异的测定性能不仅依赖于光学系统设计，更取决于实验人员对参数设置的合理控制。
在分光光度测定中，参数设置 决定了光谱分辨率、测定速度、信噪比和数据精度。
正确的参数组合能使测定结果更加稳定、灵敏，反之则可能导致误差、噪声增大或曲线失真。
本文以 Evolution 系列（如 Evolution 260、300、One/One Plus 等型号）为例，对常用参数的定义、作用、设置原则与优化方法进行系统介绍。
二、基本测量原理回顾
Evolution 分光光度计的测定原理基于 Lambert–Beer 定律：
A=εclA = \varepsilon c lA=εcl
吸光度（A）与溶液浓度（c）及光程（l）成正比。
在测定过程中，光源经单色器分光后穿透样品，比色皿中的溶液吸收部分光能，检测器接收透射光强信号，系统根据入射光强 (I₀) 与透射光强 (I) 的比值计算吸光度。
因此，仪器各项参数设置的目的在于：
控制光谱特性（波长、带宽等）；
调节测量精度与速度（步长、积分时间等）；
优化信噪比与分辨率；
匹配不同样品与检测需求。
三、主要参数分类
Evolution 的参数设置主要分为七大类：
波长与波长范围
带宽与光谱分辨率
步长与扫描速度
积分时间与信号平均
基线修正与空白模式
测定单位与输出方式
比色皿与光程选择
下面将逐一详解。
四、波长与波长范围设置
4.1 波长定义
波长是光的基本属性，也是分光光度计最核心的测定参数。Evolution 仪器的波长范围一般为 190–1100 nm，可覆盖紫外、可见及近红外区域。
4.2 固定波长设置
在单波长吸光度测定模式（Fixed Mode）中，通常手动输入测定波长。例如：
260 nm：DNA、RNA 定量；
280 nm：蛋白质纯度分析；
595 nm：Bradford 蛋白定量；
480 nm：金属配合物比色测定。
设置原则：
选择目标物质最大吸收峰（λmax）处测量；
若未知峰位，可先执行扫描以确定 λmax；
多组分混合物可采用双波长或多波长法。
4.3 扫描波长范围
在光谱扫描模式（Scan Mode）中，应设定 起始波长、终止波长 与 步长。
常见设置示例：
起始波长：200 nm；
终止波长：800 nm；
步长：1 nm。
起始波长取决于样品吸收区间，终止波长依据目标分析范围。
紫外区样品需注意光源强度衰减，应保持较短积分时间以减少噪声。
五、带宽（Bandwidth）设置
5.1 定义与意义
带宽（Spectral Bandwidth, SBW）表示单色光束通过光栅后，其波长分布宽度，单位为 nm。
带宽越窄，光谱分辨率越高，但信号强度减弱。
5.2 常用带宽范围
Evolution 系列的可调带宽通常为 0.5–5.0 nm。
紫外区（高分辨率要求）：1.0 nm 或更小；
可见区（普通定量分析）：2.0 nm；
高浓度样品或浑浊样品：3.0–5.0 nm。
5.3 设置原则
若需分辨相邻吸收峰，带宽应小于两峰间距；
若信号过弱，可适当增大带宽以增强能量；
多次测定时应保持带宽一致，以保证可比性。
六、扫描速度与步长
6.1 扫描速度（Scan Speed）
定义为光栅移动速度，即光谱扫描的快慢。单位常为 nm/min。
常见选项：
快速扫描：1200 nm/min（适用于定性筛查）；
中速扫描：600 nm/min（常规使用）；
慢速扫描：300 nm/min（提高信噪比与精度）。
设置建议：
对光谱形状要求高时选慢速；
对样品稳定性差（易分解、反应快）时选快速；
为兼顾效率与精度，一般推荐 600 nm/min。
6.2 步长（Interval）
步长为扫描间隔波长，即每次采样间距。
常用值：1 nm；
精细测定：0.5 nm；
粗略测定或快速筛查：2–5 nm。
步长越小，数据点越多、曲线越平滑，但测定时间也随之延长。
七、积分时间与信号平均
7.1 积分时间（Integration Time）
指检测器在单个数据点处的信号采集时间，单位为秒。
积分时间越长，信号平均效果越好，噪声降低，但测定速度变慢。
常用范围：
0.2–1.0 s 为常规；
微量样品或低浓度分析：1–2 s；
快速扫描：0.1–0.3 s。
7.2 信号平均次数
Evolution 软件可设置“Signal Averaging”（信号平均），即同一波长重复测定后取平均值。
一般设置 3–5 次平均，可有效提升信噪比；
若信号稳定，可选单次测定以节省时间。
八、基线修正与空白设置
8.1 空白校正原理
空白（Blank）是系统基准，用于扣除溶剂和光学系统的背景吸收。
Evolution 可自动执行空白测定，测得的 I₀ 信号被设为参考，以后每个样品吸光度均相对于空白计算。
8.2 基线修正
在光谱扫描中，可使用“Baseline Correction”功能消除基线漂移。
常见方式包括：
单点修正：在单一波长处调零；
多点修正：设定多个无吸收点进行拟合修正。
8.3 设置注意事项
空白溶液应与样品基质一致；
空白比色皿与样品比色皿应同型号；
每组实验开始前重新校正一次空白。
九、测定单位与数据输出设置
9.1 单位选择
用户可在软件中选择不同显示单位：
A（Absorbance）：吸光度；
%T（Transmittance）：透射率；
C（Concentration）：浓度（定量模式下自动计算）。
通常以吸光度 A 为主，因为它与浓度呈线性关系。
9.2 数据采样与输出间隔
可设置每多少 nm 或每秒输出一个数据点。
扫描光谱：每 1 nm 输出；
动力学测定：每 1–2 s 输出一次；
连续监测反应：可缩短至 0.1 s。
9.3 数据保存格式
Evolution 软件支持多种数据格式输出：
CSV、TXT：用于 Excel 或统计分析；
PDF：用于报告归档；
INS 文件：原始实验数据格式，便于再次分析。
十、光程与比色皿参数
10.1 光程选择
光程是吸光度计算中关键参数。
标准比色皿光程为 10 mm（1 cm），但也可根据样品浓度调整：
高浓度样品：使用短光程（1–5 mm）；
低浓度样品：可选长光程（20–50 mm）。
光程越长，吸光度越高。
需保证在仪器线性范围（0–2 A）内。
10.2 样品舱温控设置
部分型号配备恒温比色皿架，可设定温度范围 20–60 ℃，用于酶反应或动力学测定。
温控稳定性一般为 ±0.1 ℃。
十一、信号平滑与数据处理参数
11.1 平滑算法
为减少曲线噪声，可使用软件内置的“Smoothing”功能。
常见算法包括：
Moving Average（移动平均）；
Savitzky-Golay（多项式平滑）。
设置窗口宽度为 5–9 点较为合适。
平滑能去除随机噪声，但不应过度，以免掩盖真实峰值。
11.2 峰值检测
软件可自动识别最大吸收峰（λmax）及其吸光度值。
可设置峰阈值与搜索范围，避免微小噪声误判为峰。
11.3 自动存储与报告
可在“Method Setup”中设置：
自动保存每次测定结果；
自动生成报告文件；
报告内容包括参数摘要、样品名称、吸光度值与光谱曲线。
十二、定量分析参数设置
12.1 标准曲线设置
在 Quant 模式中，输入标准溶液浓度与测得吸光度，软件自动计算回归方程。
参数选项：
拟合方式：线性、一元二次、三次多项式；
坐标单位：浓度（mg/L、μg/mL 等）；
R² 判定标准：≥0.995 为理想线性。
12.2 测定样品
软件根据标准曲线自动计算未知样浓度，并可设置稀释倍数。
12.3 多波长定量
支持在多个波长同时测量，消除溶剂或杂质影响。
用户可设置主波长与参考波长（ΔA = A₁–A₂）。
十三、动力学模式参数设置
13.1 基本参数
波长：选 λmax 或反应产物特征吸收峰；
测定时间：10–900 s；
采样间隔：0.5–2 s；
延迟时间：0–10 s（用于加样稳定）。
13.2 数据处理
系统自动记录 A–t 曲线，并计算 ΔA/min（反应速率）。
可在参数界面设定：
数据平滑方式；
自动计算初速区间；
结果单位（ΔA/min 或单位活性）。
十四、参数优化与实验策略
快速筛查样品：带宽 2 nm、步长 2 nm、扫描速度 1200 nm/min。
高精度分析：带宽 1 nm、步长 0.5 nm、积分时间 1 s。
弱信号样品：适当延长积分时间并提高平均次数。
多样品测定：启用“Batch Mode”自动切换比色皿。
反应监测：使用短积分时间与恒温控制。
合理设置参数，可在保证精度的前提下大幅提高测量效率。
十五、常见错误与修正
| 问题表现 | 可能原因 | 解决建议 |
|---|---|---|
| 吸光度波动大 | 积分时间太短、光源未稳定 | 延长积分时间，预热光源 |
| 曲线噪声高 | 带宽过窄、样品浓度低 | 增大带宽或提高浓度 |
| 扫描过慢 | 步长太小、积分时间长 | 调整扫描参数 |
| λmax 偏移 | 波长校准过期 | 执行波长校准 |
| 结果重现性差 | 平均次数不足或基线未修正 | 增加平均次数、重新校正空白 |
十六、实验质量控制
每次实验应记录参数设置，确保重复性；
定期使用标准滤片验证波长与光度准确度；
每月执行一次仪器自校准与性能测试；
数据文件应保存参数摘要，便于追溯。
