赛默飞分光光度计Evolution测定步骤
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一、概述
赛默飞 Evolution 系列分光光度计 是一款高精度紫外–可见光（UV–Vis）分析仪器，广泛应用于化学分析、生命科学、环境检测、药物研究及材料科学等领域。
其测定过程的核心是利用光吸收原理测量样品在特定波长下的吸光度，从而计算物质浓度、反应速率或结构特征。
为了确保测量结果准确可靠，实验人员应严格遵循标准化的操作流程。以下详细描述 Evolution 系列分光光度计的测定步骤及关键注意事项。
二、测定前准备
2.1 实验环境要求
温度：保持在 20–25 ℃，波动不超过 ±2 ℃；
湿度：相对湿度控制在 45%–60%，避免结露；
电源：AC 220 V ±10%，独立稳压供电并接地良好；
照明与振动：仪器应远离阳光直射和震动源；
洁净度：样品舱、台面保持干燥、无灰尘和腐蚀性气体。
2.2 仪器检查
在开机前，逐项确认：
电源线连接牢固；
光源灯完好无松动；
比色皿架安装正确；
样品舱清洁、无溶液残留；
通风孔无阻塞，仪器外壳无损伤。
2.3 仪器启动与软件加载
打开主电源开关，仪器开始自检；
自检完成后，状态指示灯稳定亮起；
启动计算机，打开配套软件 Insight 或 Insight Pro；
检查软件是否自动识别设备，界面显示“已连接”状态；
等待光源预热 10–15 分钟，以稳定光强。
三、样品与比色皿准备
3.1 比色皿类型选择
| 测定波段 | 建议比色皿材质 | 光程长度 |
|---|---|---|
| 紫外区 (190–350 nm) | 石英比色皿 | 1–10 mm |
| 可见区 (350–800 nm) | 光学玻璃比色皿 | 10 mm |
| 近红外区 (800–1100 nm) | 特种玻璃或石英 | 10 mm |
3.2 比色皿清洁
使用蒸馏水或乙醇冲洗透光面；
用无绒镜头纸轻擦干净，避免划痕；
确保外壁无指纹、水滴或残留物；
使用后立即清洗并放入干燥器保存。
3.3 样品溶液准备
透明度要求：溶液应澄清、无悬浮颗粒或气泡；
浓度范围：吸光度应在 0.1–1.0 A 范围内；
样品温度：应与室温接近，避免热漂移；
空白溶液：与样品基质相同，仅不含待测物；
反应样品：对于动力学实验，应现配现测。
四、测定步骤总览
Evolution 分光光度计的标准测定步骤包括以下八个阶段：
仪器预热与初始化；
软件模式选择；
空白校正；
样品装载与测量；
波长与参数设置；
数据采集与记录；
结果分析；
实验结束与关机。
以下逐项详细说明。
五、具体测定步骤
5.1 仪器预热与初始化
开机后等待光源稳定（氙灯或钨灯约 10–15 分钟）；
观察软件状态栏，确保光强信号正常；
若长时间未使用，应执行一次波长校准。
5.2 软件模式选择
根据实验类型选择合适模式：
选择模式后，输入实验名称与文件保存路径。
5.3 空白校正
空白测定是保证结果准确的关键步骤。
操作步骤：
将空白溶液加入比色皿；
放入样品架中“参比”位置；
点击 “Blank” 或 “Zero” 按钮；
仪器自动记录背景光强并设为基准；
校正完成后取出空白比色皿，换入样品。
注意事项：
空白溶液必须与样品溶剂一致；
空白比色皿与样品比色皿应相同型号与光程；
校正完成后不得改变光程设置。
5.4 样品装载与测量
将样品溶液注入比色皿约 2/3 容积；
检查是否存在气泡，若有可轻敲去除；
擦净比色皿外壁后插入样品架；
样品插入方向应统一（有标记的一面朝外）；
关闭样品舱盖，避免外光干扰；
点击 “Measure” 启动测定。
测量完成后，软件显示吸光度或透射率结果。
5.5 波长与参数设置
在不同模式下，参数设置有所不同：
（1）固定波长模式
设置单一波长（如 260 nm、595 nm）；
选择输出单位（A 或 %T）；
输入积分时间（如 0.5–1 s）。
（2）光谱扫描模式
设定起始波长与终止波长（如 200–800 nm）；
步长：1 nm；
扫描速度：600–1200 nm/min；
选择“平滑曲线”选项以优化显示。
（3）定量模式
设定波长为 λmax；
输入标准溶液浓度及测定吸光度；
软件自动生成 A–C 曲线并拟合方程。
（4）动力学模式
设定波长与测定时间（如 340 nm，300 s）；
采样间隔（如 1 s）；
设置起始延时以排除加样误差。
5.6 数据采集与保存
测定完成后，系统自动显示测量结果。
用户可选择：
单样测定结果保存；
多样批量保存（命名自动递增）；
导出文件格式：CSV、TXT、Excel 或 PDF。
数据内容包括：
吸光度或透射率；
波长与扫描曲线；
样品编号、操作人员、测定日期；
标准曲线或动力学曲线图。
5.7 结果分析与验证
测定完成后，需对数据进行初步判断与验证。
固定波长测定结果：
吸光度 A 与浓度 C 成线性关系；
若 A > 1.5，应稀释样品后重测。
扫描光谱结果：
确认 λmax 与标准物质一致；
若曲线异常，应检查光路或样品纯度。
定量分析结果：
标准曲线的相关系数 R² ≥ 0.995；
截距接近 0 表示系统误差小。
动力学结果：
根据曲线斜率 ΔA/min 计算反应速率；
反应稳定后曲线应呈平台状态。
5.8 实验结束与关机
退出软件并保存所有实验文件；
关闭仪器主电源；
拔除 USB 或网络连接线；
清洁样品舱和比色皿架；
盖上防尘罩；
记录实验日志：实验类型、日期、样品数量、异常情况等。
六、典型实验流程举例
6.1 蛋白质测定（Bradford 法）
步骤：
选择 Quant 模式；
设定波长为 595 nm；
以蒸馏水为空白进行校正；
测定一系列标准蛋白溶液吸光度；
建立标准曲线；
测未知样品并计算浓度。
关键控制点：
显色反应时间需统一；
每次测定前充分混匀样品。
6.2 核酸测定
步骤：
选择 Fixed 模式；
波长设为 260 nm；
空白溶液为去离子水；
测 A260 与 A280；
计算 A260/A280 比值判断纯度。
结果解释：
比值约 1.8 表示 DNA 纯净；
若偏低，说明蛋白污染。
6.3 光谱扫描分析
目的： 确定 λmax 或验证物质组成。
步骤：
选择 Scan 模式；
起始波长 200 nm，终止 800 nm；
空白校正；
执行扫描并保存曲线；
读取峰值波长与吸光度。
七、注意事项与常见问题
7.1 操作注意事项
空白比色皿与样品比色皿材质必须相同；
每次实验前重新进行空白校正；
样品插入方向一致；
比色皿外壁必须干净无水迹；
样品过浓应稀释至线性范围；
反应样应及时测定，避免时间误差；
测定过程中保持舱盖关闭，防止杂散光干扰。
7.2 常见问题与排查
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 吸光度波动 | 光源未稳定 | 预热 15 分钟 |
| 无信号 | 光路遮挡或比色皿插反 | 检查光路、调整方向 |
| 吸光度过高 | 样品浓度过大 | 稀释样品 |
| 曲线漂移 | 环境温度变化 | 控制恒温 |
| 重复性差 | 比色皿未固定 | 统一方向、重复测定 |
八、实验数据整理与报告编写
8.1 数据记录
实验结束后，应记录：
仪器型号与测定参数；
样品编号与批次；
吸光度值与波长；
标准曲线方程与 R²；
操作日期与人员。
8.2 报告生成
Evolution 软件可自动生成报告，包括：
实验模式与参数；
吸光度与浓度表格；
光谱或动力学曲线；
分析结论。
8.3 数据保存
所有实验结果应双重备份（本地与外部存储）。
文件命名应包含实验日期、项目与样品编号，便于追溯。
九、测定精度与质量控制
校准周期：波长与光度每月一次；
质控样品：每日测定前用标准样验证准确性；
重复性标准：同一样品重复测定 RSD ≤ 2%；
仪器维护：光源寿命记录、比色皿定期更换；
数据审核：异常结果需复测并备注原因。
