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一、概述

赛默飞 Evolution 系列分光光度计 是一款高精度紫外–可见光分析仪器，采用双光束光学系统，具有宽波长范围（190–1100 nm）、高分辨率光栅、低噪声检测器与智能数据处理软件。
其核心测定原理基于 Lambert–Beer 定律，通过测量样品吸收特定波长光的强度，计算物质浓度或结构特征。

“样品测定” 是整个实验流程的核心环节，直接影响数据的准确性与可重复性。
本文将从样品准备、空白校正、测定模式、数据记录与误差控制五个方面，系统说明 Evolution 分光光度计的样品测定流程。

二、样品测定原理

Evolution 仪器通过比较样品与参比（空白）在特定波长下透射光强的差异，计算吸光度（A）：

A=−log⁡10(II0)A = -\log_{10} \left(\frac{I}{I_0}\right)A=−log10(I0I)

其中：

• I 为样品透射光强；

• I₀ 为入射光强；

• 吸光度 A 与样品浓度 c 成正比（A = εcl）。

样品吸收的光越多，透射光越弱，吸光度越高。通过建立标准曲线，可由吸光度反推样品浓度。

三、样品测定前的准备工作

3.1 实验环境要求

• 温度：保持在 20–25 ℃，避免大幅波动；

• 湿度：45%–60%；

• 电源：AC 220 V ±10%，接地良好；

• 实验台：稳固、防震、防尘；

• 光照：避免强光直射样品舱。

3.2 仪器检查

1. 打开电源后让仪器自检；

2. 启动软件（Insight / Insight Pro），检查连接状态；

3. 检查样品舱是否干净、无残留溶液；

4. 光源预热 10–15 分钟，使光强稳定。

3.3 比色皿与样品准备

（1）比色皿选择

• 石英比色皿：用于紫外区（190–350 nm）；

• 光学玻璃比色皿：用于可见区（350–900 nm）；

• 塑料比色皿：适用于一般教学或非强酸碱样品。

（2）比色皿清洁

• 用蒸馏水或乙醇清洗透光面；

• 擦拭时使用镜头纸，避免划痕；

• 放入干燥器备用。

（3）样品溶液准备

• 溶液必须澄清透明；

• 若有悬浮颗粒或气泡，应过滤或超声除泡；

• 稀释样品至吸光度在 0.1–1.0 A 范围内。

（4）空白溶液

• 为空白校正提供基准信号；

• 组成应与样品一致，只缺待测成分。

四、样品测定的基本流程

样品测定包括 空白校正 → 模式选择 → 样品测量 → 数据记录 → 结果分析 五个阶段。

4.1 空白校正

空白测定用于消除溶剂、容器及光学系统对吸光度的影响。

步骤：

1. 将空白溶液注入比色皿；

2. 放入样品架指定位置；

3. 关闭样品舱盖；

4. 点击软件中的 “Blank” 或 “Zero” 按钮；

5. 系统自动校正为 A=0 或 T=100%；

6. 空白测定完成后，取出比色皿并立即更换样品。

4.2 模式选择

Evolution 分光光度计具备多种测定模式，根据实验目的选择相应方式。

（1）固定波长模式（Fixed）

用于测定样品在特定波长下的吸光度或透射率。

• 设置波长（如 595 nm、260 nm）；

• 选择光度单位（A 或 %T）；

• 进行空白校正；

• 插入样品比色皿，点击 “Measure”。

结果会以吸光度或透射率形式显示，可直接用于浓度计算或标准曲线建立。

（2）光谱扫描模式（Scan）

用于绘制样品吸收光谱，确定最大吸收峰（λmax）。

• 设定起始与终止波长（如 200–800 nm）；

• 设置扫描速度（如 1200 nm/min）；

• 空白校正后插入样品；

• 点击 “Start Scan”；

• 系统自动扫描并绘制曲线。

扫描曲线能反映样品的结构特征与纯度，是定性分析的重要依据。

（3）定量分析模式（Quant）

用于建立标准曲线并测定未知样品浓度。

操作步骤：

1. 设置测定波长（通常为 λmax）；

2. 测定一系列标准溶液的吸光度；

3. 软件自动拟合 A–C 曲线并显示方程 A = aC + b；

4. 测定未知样品吸光度；

5. 自动代入方程计算浓度。

此模式适合用于药物、蛋白质、金属离子等定量分析。

（4）动力学模式（Kinetics）

用于研究反应速率和酶活性。

步骤：

• 选择 Kinetics 模式，设定波长与时间间隔；

• 执行空白校正；

• 加入样品后立即放入比色皿架；

• 软件实时记录吸光度随时间的变化曲线 A–t；

• 系统自动计算反应速率 ΔA/min 或酶活性单位。

4.3 样品测量

空白校正完成后，进行正式样品测定。

操作要点：

1. 样品比色皿外壁必须干净，无指纹与水迹；

2. 插入样品架时，保证光路方向一致；

3. 若测多组样品，应依次快速更换，避免光源漂移；

4. 每组样品建议测定 2–3 次取平均值。

软件界面：

• 实时显示吸光度、波长与测定时间；

• 支持多样品批量测定与自动保存；

• 可通过 “Overlay” 功能对比多条光谱曲线。

五、测定实例

5.1 蛋白质浓度测定（Bradford 法）

原理：考马斯亮蓝与蛋白结合形成蓝色复合物，吸收峰在 595 nm。

实验步骤：

1. 配制标准蛋白溶液（0–1.0 mg/mL）；

2. 加入染料试剂反应 5 分钟；

3. 使用空白溶液校正；

4. 测定标准溶液与样品的吸光度；

5. 建立标准曲线，计算未知样品浓度。

注意事项：

• 反应时间必须一致；

• 颜色稳定时间不宜超过 10 分钟；

• 样品过浓需稀释至 0.1–1.0 A。

5.2 核酸纯度检测

原理：DNA 在 260 nm 吸收峰最强，蛋白质在 280 nm。
通过 A260/A280 比值评估纯度。

步骤：

1. 使用蒸馏水为空白；

2. 测定样品在 230、260、280 nm 处吸光度；

3. 计算 A260/A280 和 A260/A230；

4. 纯 DNA 比值约为 1.8，RNA 为 2.0。

应用：判断提取样品是否受蛋白或盐污染。

5.3 化学溶液光谱扫描

例如 Fe³⁺–SCN⁻ 络合物在 480 nm 处有明显吸收峰。
通过扫描 350–700 nm 波段可获取其光谱特征，用于确认反应生成物及浓度变化。

六、测定结果的分析与数据处理

6.1 吸光度与浓度关系

在浓度范围内（一般 0.1–1.0 A），吸光度与浓度成线性关系。
若超出范围，可能出现非线性效应，应稀释样品或使用短光程皿。

6.2 光谱特征分析

光谱峰的位置（λmax）和形状可用于物质鉴别：

• 峰位偏移说明化学结构变化或溶液条件改变；

• 多峰现象可能表示混合物或杂质存在；

• 峰宽反映分子电子跃迁特征。

6.3 软件数据处理

Evolution 软件可自动输出：

• 吸光度表格；

• 光谱图；

• 浓度计算结果；

• 峰值及波长分析；

• 报告文件（CSV、PDF、Excel）。

七、影响测定结果的因素

1. 光源波动：应充分预热并定期更换灯泡；

2. 比色皿污染或划伤：影响透光率，应保持清洁；

3. 气泡与悬浮颗粒：导致散射，应除泡或过滤；

4. 样品浓度：过高或过低均影响线性范围；

5. 温度变化：部分反应吸收峰对温度敏感；

6. 操作顺序不一致：反应类实验必须严格同步操作。

八、误差控制与数据可靠性

8.1 重复性检测

每个样品至少测定 3 次，计算平均值与标准偏差。
若偏差超过 2%，需检查操作或仪器状态。

8.2 质控样品

使用已知浓度标准溶液定期验证仪器准确度。

8.3 仪器校准

• 每月执行波长与光度校准；

• 校准结果记录在维护日志中。

8.4 环境稳定性

实验期间应保持温度恒定，避免光源闪烁或气流影响。

九、样品测定的优化建议

1. 空白匹配：空白溶液必须与样品基质一致，防止溶剂吸收差异。

2. 样品顺序：先测标准后测未知，保证校正连续性。

3. 稀释精确：使用移液器精确配制样品浓度。

4. 比色皿放置方向一致：防止光程误差。

5. 时间控制：显色反应要在同一时间点测定。

6. 数据保存及时：实验后立即保存，避免丢失。

十、样品测定中常见问题

十一、实验安全与维护

1. 使用仪器时应关闭样品舱盖，避免紫外光辐射；

2. 加样或清洗时避免溶液溅入仪器内部；

3. 测定结束后关闭软件与电源；

4. 清洁比色皿与样品舱，盖上防尘罩；

5. 定期校准光度与波长性能。