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一、概述

赛默飞 Thermo Scientific Evolution 系列分光光度计是一类利用光吸收原理进行定量与定性分析的高精度光学仪器。
它广泛应用于生物化学、医药分析、环境检测、食品检验以及材料科学研究中，用于测定溶液中物质的浓度、反应速率及分子吸收特征。

Evolution 系列的核心技术基于 Lambert–Beer 定律，通过比较样品透射光与参比光强度，计算吸光度，从而反映溶液中吸收物质的含量。
其光学系统采用 双光束结构、高精度全息光栅和高灵敏度检测器，保证了极高的波长准确度和光度稳定性。

二、分光光度检测的理论基础

2.1 Lambert–Beer 定律

分光光度测定的基本原理为：当平行单色光通过吸光物质溶液时，透射光强与吸收物质浓度和光程呈指数关系。

公式如下：

A=εclA = \varepsilon c lA=εcl

其中：

• A 为吸光度（Absorbance）；

• ε 为摩尔吸收系数（L · mol⁻¹ · cm⁻¹）；

• c 为溶液中物质浓度（mol · L⁻¹）；

• l 为光程长度（cm）。

吸光度与透射光强 I 和入射光强 I₀ 之间的关系为：

A=−log⁡10(II0)A = -\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right)A=−log10(I0I)

当 ε 和 l 一定时，吸光度 A 与浓度 c 成正比。由此，可以通过测定吸光度求得样品浓度。

2.2 透射率与吸光度的关系

透射率 T 定义为：

T=II0×100%T = \frac{I}{I_0} \times 100\%T=I0I×100%

吸光度与透射率关系：

A=2−log⁡10TA = 2 - \log_{10}TA=2−log10T

在实验测定中，Evolution 仪器通常直接显示吸光度值，因为 A 与浓度成线性关系，便于定量计算。

三、Evolution 光学系统的结构与工作原理

3.1 总体结构

Evolution 分光光度计的光学系统主要由以下部分组成：

1. 光源系统：提供稳定宽谱连续光；

2. 单色器（分光系统）：将复合光分解为单色光；

3. 样品与参比系统：用于测量样品与空白的透射光强；

4. 检测器：接收光信号并转换为电信号；

5. 信号处理系统：将电信号转换为吸光度或透射率；

6. 控制与软件系统：实现波长调节、数据采集、分析与存储。

该系统设计为 双光束式结构，即光束一分为二，同时照射样品和参比通道，从而自动抵消光源波动或电路漂移造成的误差。

3.2 光源系统

Evolution 系列通常采用 氙灯光源 或 氘/钨组合光源。

• 氙灯光源：具有连续光谱、强度高、预热时间短等特点，可覆盖 190 – 1100 nm 波段。

• 氘灯：提供紫外区 190 – 360 nm 连续辐射。

• 钨灯：覆盖可见至近红外区 320 – 1100 nm。

系统在不同波长自动切换光源，以获得最佳信噪比。光源发出的复合光经过光阑和反射镜准直后进入分光系统。

3.3 分光系统（单色器）

分光装置的任务是将复合光分解为单一波长的光。Evolution 系列使用 全息光栅单色器。

光栅工作原理：

光栅表面刻有大量平行刻线（通常 1200 线/mm），当光照射到光栅表面时，不同波长的光发生衍射与干涉，沿不同角度传播。仪器通过改变光栅角度选择特定波长的光输出。

波长的分离满足条件：

d(sin⁡i+sin⁡θ)=nλd(\sin i + \sin \theta) = n\lambdad(sini+sinθ)=nλ

其中 d 为光栅刻线间距，i 为入射角，θ 为衍射角，n 为衍射级次。

通过精密的步进电机和编码器控制光栅角度，Evolution 能以 0.1 nm 步进精度实现高分辨率波长扫描。

3.4 样品与参比系统

分光后的单色光经分束镜分为两束：

• 一束通过样品比色皿；

• 另一束通过参比（空白）比色皿。

样品中被分析物会吸收特定波长的光，使透射光强 I 减弱；参比溶液不含吸收物质，其透射光强 I₀ 作为基准。

检测器同时接收两束光信号，通过计算 I/I₀ 即可得出透射率 T 或吸光度 A。
双光束结构消除了光源波动和电子噪声对测定的影响，提高了测量的稳定性与精度。

3.5 检测器与信号转换

Evolution 系列仪器根据型号不同，配置 硅光二极管 (Si-Photodiode) 或 光电倍增管 (PMT) 作为检测器。

工作过程：

1. 检测器接收透射光，光子能量激发半导体材料产生电荷；

2. 电荷转化为电流信号，与光强成正比；

3. 经放大器与模数转换器（A/D Converter）处理后，传入微处理器；

4. 系统自动计算 A = –log(I/I₀)，显示吸光度值。

该检测系统灵敏度高、响应快，能够实现毫秒级的信号采样，适合快速扫描及动力学实验。

四、检测模式与原理拓展

Evolution 分光光度计不仅能进行传统的吸光度测定，还支持多种实验模式。

4.1 吸光度/透射率模式

在固定波长下测定样品吸光度或透射率，是最基本的测定方式。
仪器自动进行空白校正，输出 A 或 %T 值。

原理核心：在该模式下，检测器实时比较 I 与 I₀ 信号，通过对数计算得到吸光度。
若进行多样测定，系统在同一波长条件下依次采集各样品数据，实现快速定量分析。

4.2 光谱扫描模式

此模式通过连续改变光栅角度，获得样品在一系列波长下的吸光度分布。
其本质是测量吸光度 A(λ) 随波长 λ 变化的函数关系，形成完整的光谱图。

意义：

• 确定物质的特征吸收峰 (λmax)；

• 判断样品纯度或组分差异；

• 选择定量测定波长。

扫描过程中，系统自动同步检测样品与参比信号，实时计算并绘图。

4.3 定量分析模式

基于 Lambert–Beer 定律，在一定浓度范围内 A 与 c 成线性关系。
通过测定一系列标准溶液的吸光度，可得线性方程：

A=aC+bA = aC + bA=aC+b

其中 a 为斜率（εl），b 为截距（理论上接近 0）。
样品测得 A 值后，即可代入方程求得浓度 C。

Evolution 软件可自动拟合曲线并输出相关系数 R²，以评估线性程度。

4.4 动力学分析模式

用于研究化学反应或酶促反应速率。
原理是在固定波长下，连续记录样品吸光度随时间变化 A(t)。

若反应遵循一级动力学，吸光度随时间呈指数变化；软件可自动计算 ΔA/min 或反应速率常数 k。

此模式依赖检测器的高时间分辨率和稳定性，可在数秒至数十分钟的时间尺度上监测吸收变化。

五、杂散光与信噪比控制

5.1 杂散光产生原因

杂散光是指与设定波长不同的光进入检测器，会导致测量误差。主要来源：

• 光学部件反射或散射；

• 光栅高阶衍射光未被完全滤除；

• 比色皿污染导致散射。

5.2 抑制措施

Evolution 仪器通过多种设计降低杂散光：

1. 使用高品质反射镜与防反射涂层；

2. 设置光阑与狭缝系统；

3. 采用滤光片阻断高阶衍射；

4. 软件自动进行基线修正。

结果使仪器杂散光小于 0.05% （在 220 nm 时），保证高光度准确度。

六、信号处理与数据输出原理

1. 信号放大：检测器输出的微弱电流通过运算放大器放大；

2. 模数转换：A/D 转换器将模拟信号数字化；

3. 数据校正：软件自动扣除暗电流与背景噪声；

4. 吸光度计算：根据公式 A = –log(I/I₀) 实时计算；

5. 结果呈现：显示吸光度曲线、透射率或浓度数据。

仪器内置数字滤波算法，对信号进行平滑处理，以提高曲线稳定性和分辨率。

七、温度与环境对检测的影响

光学系统的性能易受温度、湿度及外界干扰影响。

• 温度升高：引起光栅热膨胀，使波长略偏移；

• 湿度过高：可能造成光窗结露，导致散射增加；

• 电源波动：造成检测信号不稳。

Evolution 系列在设计上加入温度传感与电子稳流系统，通过反馈控制减小环境变化的影响。实验时仍建议保持室温恒定（20–25 ℃）。

八、精度与稳定性控制原理

8.1 波长精度

依靠高分辨率光栅与步进电机控制系统实现。编码器实时监测光栅角度，保证每步移动对应精确波长，误差通常 ≤ ±0.3 nm。

8.2 光度精度

通过参比补偿与自动校正实现。系统同时测量样品与参比信号，计算比值消除光源波动。光度误差一般 ≤ ±0.005 A。

8.3 重复性

Evolution 采用稳定的双光束结构和高信噪比检测器，使同一样品重复测定标准偏差 ≤ 0.001 A。

九、特殊检测技术原理

9.1 多波长测定

在某些化学反应中，多个波长共同反映组分变化。
Evolution 可设定多波长同时检测，通过算法分离各组分吸收贡献，实现多组分分析。

9.2 导数光谱分析

软件可计算一阶或二阶导数光谱，以分辨重叠吸收峰，提高分析分辨率。

9.3 差谱法原理

通过扫描反应前后样品光谱并求差，突出反应生成物或中间体的特征峰。

十、检测原理在应用中的体现

1. 核酸检测：
   核酸分子在 260 nm 有最大吸收峰，蛋白质在 280 nm 有峰。通过测 A260/A280 比值可判断纯度。

2. 蛋白质定量：
   利用染料与蛋白结合形成有色络合物，在 595 nm 吸收，吸光度与浓度成正比。

3. 化学比色反应：
   例如 Fe³⁺–SCN⁻ 络合物在 480 nm 有强吸收，用于铁含量分析。

4. 动力学监测：
   在固定波长下记录吸光度随时间变化，计算反应速率常数。

5. 材料透射分析：
   测定薄膜或纳米材料在可见光区的透射率，研究其光学性质。

这些应用都源于 Evolution 仪器对光强变化的高精度测量和对吸收定律的准确实现。

十一、误差来源与校正机制

11.1 系统误差

包括波长偏移、光度漂移、光源波动等。仪器通过自动参比补偿、周期自校准及温控电路加以修正。

11.2 随机误差

主要来自电子噪声与环境扰动。通过数字滤波与平均算法降低噪声。

11.3 操作误差

由样品准备不当或比色皿污染引起，需严格遵守实验规范。