赛默飞分光光度计Evolution校准方法
即便是高端的赛默飞（Thermo Fisher Scientific）Evolution 系列分光光度计，在长期使用过程中也会因光源老化、光栅漂移或电子噪声变化而出现细微偏差。
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一、概述
分光光度计的测量精度依赖于光学系统、光源强度、检测器灵敏度及数据处理算法的综合稳定性。
即便是高端的赛默飞（Thermo Fisher Scientific）Evolution 系列分光光度计，在长期使用过程中也会因光源老化、光栅漂移或电子噪声变化而出现细微偏差。
因此，定期校准（Calibration） 是保证仪器保持最佳性能、测量结果准确可溯的重要步骤。
校准不仅恢复设备的光学基准，更是符合 ISO/IEC 17025、GLP、CFR21 Part 11 等国际实验室管理体系要求的关键环节。
本文将系统介绍 Evolution 系列分光光度计的校准原理、操作流程、标准样品选择及误差控制方法，帮助实验室建立科学的校准体系。
二、校准的目的与分类
1. 校准的主要目的
确保仪器测量结果与标准值的一致性；
检验光学系统的稳定性与重复性；
排除因环境或光源衰减引起的系统偏差；
保证实验数据符合规范性标准，便于审计与追溯。
2. 校准类型
Evolution 系列的校准一般分为五类：
波长校准（Wavelength Calibration）
确定光栅分光角度与真实波长对应关系。吸光度校准（Photometric Calibration）
检查检测器线性度与光度精度。杂散光校准（Stray Light Test）
验证光谱纯度，防止非目标波长光进入检测系统。基线稳定性与噪声检测（Baseline Calibration）
确认系统漂移和电气噪声水平是否在标准范围内。光源能量校准（Lamp Energy Calibration）
检查氘灯与钨灯能量输出是否正常，是否需要更换。
三、校准周期与环境要求
1. 校准周期建议
| 校准项目 | 推荐周期 | 说明 |
|---|---|---|
| 波长校准 | 每季度一次 | 使用氧化钬滤光片或钕滤片 |
| 吸光度校准 | 每半年一次 | 使用重铬酸钾标准溶液 |
| 杂散光测试 | 每年一次 | 检测光谱纯度与杂光水平 |
| 基线稳定性 | 每月一次 | 观察仪器漂移与噪声变化 |
| 光源能量校验 | 每月一次 | 检查光源衰减趋势 |
2. 校准环境要求
室温稳定在 20–25℃；
湿度 40%–70%，无冷凝；
电源稳定，建议使用稳压电源；
避免阳光直射与强电磁干扰；
校准期间保持样品舱干燥清洁。
四、波长校准
1. 校准原理
波长校准旨在验证光栅角度与输出波长的一致性。
Evolution 系列通过测定标准滤光片的特征吸收峰位置，并与理论值比较，修正波长偏差。
2. 使用标准
常用校准滤光片包括：
氧化钬（Holmium Oxide）滤光片：具有 241.1 nm、279.4 nm、361.5 nm、453.7 nm、536.3 nm、638.2 nm 等特征吸收峰；
钕（Didymium）滤光片：在 570 nm 与 875 nm 附近有明显峰值。
3. 操作步骤
打开仪器并预热光源 20 分钟；
在“Maintenance”或“Calibration”菜单中选择“Wavelength Calibration”；
将氧化钬滤光片放入样品舱；
系统自动扫描 200–800 nm 范围；
仪器识别峰位并与标准值比较；
若偏差 ≤ ±0.3 nm，则校准合格；
若偏差超限，执行“Recalibrate”自动调整光栅零点。
4. 注意事项
每次更换光源后应重新执行波长校准；
校准时避免外部光线进入样品舱；
滤光片表面应清洁、无划痕。
五、吸光度校准
1. 校准原理
吸光度校准用于检测光电转换系统的线性响应及光度准确性。
根据朗伯–比尔定律，在一定范围内吸光度与浓度成正比，因此标准溶液应具有已知吸收特性。
2. 标准溶液
常用标准为 重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）标准溶液。
典型浓度：0.006 mol/L，使用 0.005 mol/L H₂SO₄ 溶液配制。
理论吸光度值：
| 波长（nm） | 吸光度标准值 |
|---|---|
| 235 | 0.640 |
| 257 | 0.520 |
| 313 | 0.190 |
| 350 | 0.370 |
3. 校准步骤
选择“Photometric Calibration”模式；
使用蒸馏水作空白进行基线校正；
置入标准溶液，测定各波长吸光度；
系统自动与理论值比较；
若偏差 ≤ ±0.005 A，则校准合格；
若超限，系统提示“Adjust Photometric Scale”。
4. 检查线性范围
为验证检测器线性，可使用 0.002–0.01 mol/L 系列浓度重铬酸钾溶液。
绘制 A–CA–CA–C 曲线，线性相关系数 R2≥0.999R² ≥ 0.999R2≥0.999 视为合格。
六、杂散光检测
1. 校准目的
杂散光是指非目标波长光线进入检测系统，造成高吸光度样品读数偏低。
控制杂散光是保证光谱纯度的关键。
2. 测试标准
推荐使用以下标准溶液：
| 测试波长 | 溶液类型 | 判定标准 |
|---|---|---|
| 220 nm | 1% NaI 溶液 | ≤ 0.05%T |
| 340 nm | 1% NaNO₂ 溶液 | ≤ 0.05%T |
| 400 nm | 0.4% K₂Cr₂O₇ 溶液 | ≤ 0.05%T |
3. 操作步骤
选择“Stray Light Test”功能；
插入相应溶液比色皿；
系统自动检测透过率；
若 T ≤ 0.05%，则杂散光符合要求；
若超过限值，应检查样品舱密封性或光源能量。
4. 原因分析与处理
杂光偏高原因：
光学元件污染或老化；
光源安装角度偏移；
样品舱内有灰尘或反射面损伤。
处理措施：
清洁光学窗口；
重新校准光源位置；
必要时由专业工程师更换光栅或反射镜。
七、基线与噪声校准
1. 校准目的
基线校准用于检测仪器的零点漂移与电气噪声情况。
长时间使用后，电子系统温度变化或电源波动可能导致基线偏移。
2. 操作流程
取下比色皿，关闭样品舱门；
选择“Baseline Check”；
执行空白扫描（190–800 nm）；
记录基线波动范围；
若波动 ≤ ±0.0003 A，则系统稳定；
若波动增大，建议重新接地或校正检测器增益。
3. 噪声校验
在固定波长（如 500 nm）记录空白信号 60 秒，计算标准偏差 SD。
噪声限值应小于 ±0.0002 A。
若噪声超限，应检查光源稳压电路与环境干扰。
八、光源能量校准
1. 目的
用于评估氘灯和钨灯的能量输出与衰减状态。
当光源老化时，能量输出下降，基线漂移和测量误差会增大。
2. 操作方法
进入“Lamp Energy Test”菜单；
系统自动测量光源输出能量曲线；
能量低于 70% 标准值时会提示“Lamp Energy Low”；
此时应考虑更换光源并重新执行波长与吸光度校准。
3. 光源更换后检查
安装新灯后运行“Lamp Alignment”程序；
检查能量曲线平滑性与强度分布；
重新执行波长与光度校准以恢复一致性。
九、校准数据记录与管理
1. 数据记录
Evolution 系列可自动保存每次校准数据，包括：
校准类型与日期；
标准样品编号；
校准前后偏差值；
操作员信息与设备编号。
2. 审计追踪
系统符合 21 CFR Part 11 要求，自动生成时间戳与用户签名，防止数据篡改。
管理员可在“Calibration Log”中查看完整校准历史。
3. 报告生成
自动生成 PDF 或 CSV 格式校准报告；
包含结果判定、偏差曲线与系统状态说明；
可导出至 USB 或上传至 LIMS 实验室信息系统。
十、误差来源与控制措施
| 误差类型 | 可能原因 | 控制措施 |
|---|---|---|
| 波长偏差 | 光栅磨损、步进电机老化 | 定期波长校准 |
| 吸光度误差 | 检测器漂移、光源衰减 | 光度校准与能量测试 |
| 杂散光干扰 | 光学窗口污染 | 清洁样品舱与窗口 |
| 环境因素 | 温湿度波动、电磁干扰 | 稳压电源与恒温环境 |
| 操作误差 | 滤光片放置方向错误 | 严格执行标准流程 |
十一、定期验证与第三方比对
1. 定期验证
除内部校准外，建议每 12 个月由厂家或授权计量机构进行一次第三方验证，确保仪器溯源性。
验证内容包括：
波长与光度双重校正；
光源输出光谱测试；
检测器线性与稳定性评估；
全系统校准证书出具。
2. 比对实验
实验室可使用参考仪器进行对比测量，如标准样品吸光度比对。
若结果偏差大于 ±0.5%，应重新执行全套校准程序。
十二、质量保证与管理体系
Evolution 系列支持 GLP 模式，可通过软件实现：
校准状态锁定（未校准时禁止测试）；
定期提醒功能（自动提示下次校准日期）；
用户权限控制（仅授权人员可执行校准）。
这些功能确保设备始终处于受控状态，符合实验室质量体系要求。
