赛默飞分光光度计BioMate实验方案
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一、实验方案设计概述
赛默飞（Thermo Scientific）BioMate 系列分光光度计是一种高精度紫外–可见光吸收检测仪器，适用于样品浓度分析、光谱特征测定、酶动力学研究及反应速率监测。
制定完善的实验方案，是确保实验数据准确、重复性良好和实验结果可追溯的基础。
BioMate 实验方案的核心目标包括：
明确实验目的与检测指标；
合理设置测定参数与校正条件；
确保样品制备、空白对照与仪器操作规范统一；
通过系统化流程提高数据的科学性与可比性。
二、实验原理与技术基础
BioMate 的实验方案设计基于 Lambert–Beer 定律：
A=εclA = \varepsilon c lA=εcl
其中，A 为吸光度，ε 为摩尔吸收系数，c 为浓度，l 为光程。
当光通过样品溶液时，部分能量被吸收，吸收量与样品浓度成正比。
因此，通过测定吸光度即可间接计算浓度或分析反应进程。
仪器采用双光束结构，样品光路与参比光路同步检测，可有效消除光源波动与环境干扰。配合高精度光栅和自动增益系统，BioMate 可实现 190–1100 nm 范围内的光谱测量。
三、实验方案总体流程
完整的实验方案应包括以下阶段：
四、实验准备
4.1 仪器环境
温度控制在 20～25 ℃，湿度不高于 60%；
电源 220V±10%，接地良好；
避免阳光直射与强磁干扰；
仪器放置平稳，样品舱干净无尘。
4.2 仪器检查
检查电源线与数据线连接稳固；
启动系统，确认光源（氙灯或氘灯）工作正常；
确保比色皿清洁、无划痕；
若长期未使用，开机后预热 15 分钟稳定光强。
五、实验样品制备
5.1 样品要求
样品应澄清透明，无沉淀或悬浮颗粒；
浓度应控制在吸光度 0.1–1.0 A 区间内；
若样品浓度过高，应进行稀释；
溶液需充分混匀并静置消泡。
5.2 空白溶液
选用与样品相同的溶剂；
不含分析物，用于基线校正；
若溶剂更换或反应体系改变，应重新测空白。
5.3 比色皿选择与清洁
石英比色皿（190–1100 nm 通用）；
光程标准为 10 mm；
清洗后用无绒纸擦干，避免手指触及光窗。
六、实验模式设计
BioMate 提供五大核心实验模式，方案制定时应根据研究目的合理选用。
6.1 吸光度模式（Absorbance Mode）
用于测定样品在单一波长下的吸光值。
波长设置：根据样品 λmax 选择（如 595 nm、260 nm 等）；
适用于快速定量与样品稳定性测试。
6.2 浓度模式（Concentration Mode）
在已知吸收系数或标准曲线基础上计算样品浓度。
可采用系数法或多点校准法；
适合化学比色分析与核酸、蛋白质定量。
6.3 光谱扫描模式（Spectrum Mode）
对样品在 190–1100 nm 范围内进行全波长扫描，绘制吸收曲线。
用于确定吸收峰 λmax、研究光谱特征或检测杂质。
6.4 动力学模式（Kinetics Mode）
监测吸光度随时间变化，分析反应速率。
适合酶促反应或化学反应动力学实验。
6.5 BioTest 模式
内置核酸、蛋白等生物样品测定程序，自动输出浓度与纯度比值。
七、实验参数设置
| 参数 | 含义 | 建议设置 |
|---|---|---|
| 起始波长 | 扫描起点 | 200 nm（紫外区） |
| 终止波长 | 扫描终点 | 800 nm 或 1100 nm |
| 步长 | 光栅移动间隔 | 1.0 nm |
| 光谱带宽 | 单色光宽度 | 1.0 nm |
| 扫描速度 | 光栅转速 | Normal 模式 |
| 光度单位 | A 或 %T | 建议选择 A |
| 平滑与修正 | 数据滤波与基线校正 | ON |
实验方案中可根据样品特性调整分辨率与扫描时间平衡点。
八、检测与测定流程
8.1 空白校正
将空白比色皿放入样品架；
关闭舱盖并点击“Blank”；
仪器自动测定基线并设定为 0.000；
屏幕提示“Blank Done”后取出空白比色皿。
8.2 样品检测
放入样品比色皿；
点击“Measure”或“Start”；
系统自动记录吸光度值；
多样测定时按序更换比色皿；
结果自动显示在屏幕与数据表中。
8.3 光谱扫描
设置波长范围与步长；
进行空白校正；
点击“Scan”，系统实时绘制曲线；
扫描结束后自动标注吸收峰。
8.4 浓度测定
若采用系数法：输入 ε 与光程 l，自动计算浓度；
若采用标准曲线法：输入标准样浓度与吸光度，系统回归方程自动计算未知样浓度。
8.5 动力学测定
设置波长（如 340 nm）；
确定总时长与间隔（1 s～60 s）；
加入底物后立即点击“Start”；
记录反应曲线并计算速率常数。
九、数据记录与结果分析
9.1 实验数据输出
测定完成后，系统可显示：
吸光度 A；
浓度 C；
峰值 λmax；
时间曲线或速率 ΔA/min；
回归方程与相关系数 R²。
9.2 数据保存
内部存储：可保存上千组数据；
外部导出：USB（CSV、TXT、PDF 格式）；
建议命名规则：“日期_样品名_模式”。
9.3 结果处理
平均值与标准偏差计算；
光谱归一化与叠加比较；
背景扣除与平滑处理；
比值分析（如 A260/A280）。
9.4 报告生成
BioMate 可直接生成测定报告，包括：
样品信息、操作人、检测模式；
参数设置与吸收曲线；
数据表格与统计分析。
十、实验质量控制
10.1 校准与验证
波长校准：使用钕玻璃或钬滤光片；
光度线性验证：使用中性密度滤片（0.2–1.0 A）；
噪声测试：空白重复测定 SD≤0.001 A。
10.2 重复性与稳定性
同一样品测定 3 次，偏差应小于 ±0.003 A。
基线漂移 ≤0.001 A/h，说明仪器运行稳定。
10.3 样品与比色皿一致性
保持比色皿方向、体积、位置一致；
每组样品均应使用同一类型比色皿。
十一、常见误差及修正
| 误差类型 | 原因分析 | 修正措施 |
|---|---|---|
| 吸光度偏高 | 比色皿污染、背景光强过弱 | 清洗光窗、重新校零 |
| 吸光度偏低 | 样品浓度过高或光程短 | 稀释样品或更换比色皿 |
| 基线漂移 | 环境温度变化或光源衰减 | 保持恒温、检查光源 |
| 光谱噪声大 | 步长太小、积分时间过短 | 调整参数或启用平滑功能 |
| 无信号 | 光路遮挡或比色皿放反 | 检查样品舱与比色皿方向 |
十二、实验方案实例
实例 1：蛋白质浓度测定（Bradford 法）
原理： 染料与蛋白结合后在 595 nm 产生吸收峰，吸光度与浓度成正比。
步骤：
模式：Concentration；
波长：595 nm；
空白液：试剂空白；
建立标准曲线（浓度 0.1–1.0 mg/mL）；
测定未知样吸光度；
系统计算浓度并输出方程。
结果判断： R²≥0.999 表示线性良好。
实例 2：核酸纯度测定
原理： 核酸在 260 nm 吸收峰明显，蛋白质在 280 nm 吸收峰强。
A260/A280 比值反映纯度。
步骤：
模式：BioTest → Nucleic Acid；
波长：230、260、280 nm；
空白：蒸馏水；
测定吸光度并自动输出浓度与比值。
结果判定：
A260/A280 = 1.8（纯 DNA），A260/A230 ≈ 2.0（纯 RNA）。
实例 3：光谱扫描确定吸收峰
目的： 确定显色反应 λmax。
步骤：
模式：Spectrum；
范围：200–700 nm；
步长：1 nm；
空白校正后扫描；
λmax 出现在 485 nm，作为定量测定波长。
十三、实验安全与注意事项
不得在仪器附近使用易燃溶剂；
避免紫外光照射眼睛；
样品如含腐蚀性溶液，应使用密闭比色皿；
清洁时切断电源，禁止用湿布擦屏幕；
实验结束后及时记录数据并盖防尘罩。
十四、实验方案优化建议
前期预实验：用于确定最佳波长与浓度范围；
重复测定：提高统计可靠性；
多模式结合：光谱扫描 + 定量分析联合使用；
温度控制：避免热反应造成光谱漂移；
数据标准化：采用相对吸光度法进行样品比较。
