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一、前言

分光光度法是一种基于物质对特定波长光吸收特性的定量分析方法，被广泛应用于生物化学、药物分析、环境检测与材料研究等领域。
在这一类分析中，测量结果的可靠性高度依赖于仪器性能、实验条件和操作方法的稳定性。

赛默飞（Thermo Fisher Scientific）旗下的 BioMate 系列分光光度计 以高精度光学系统和智能化数据处理功能著称，其设计目标是最大限度降低系统误差与操作误差。然而，在长期使用过程中，由于光学元件老化、环境条件波动或人为因素影响，仍可能出现一定测量误差。

本文将系统分析 BioMate 分光光度计在使用过程中可能产生的各类误差来源，并提出相应的控制与修正措施，为实验人员提供科学的质量管理依据。

二、误差的分类与定义

根据误差产生的性质和表现形式，可将分光光度计测量误差分为三类：

1. 系统误差（Systematic Error）：由仪器结构缺陷、校准偏差或环境因素引起，通常具有固定方向和规律性。

2. 随机误差（Random Error）：由实验操作、样品状态及检测噪声等偶然因素引起，数值方向不定。

3. 粗大误差（Gross Error）：由明显操作错误或设备故障造成，如样品加错或比色皿放反。

在实际分析中，系统误差是决定仪器准确度的关键，而随机误差则影响测量的重复性。BioMate 的误差分析主要围绕这两类展开。

三、光学系统误差分析

1. 波长准确度偏差

波长准确度 是决定吸光度测量精度的核心指标。若波长偏移，吸光度值将出现系统性偏差，尤其在吸收峰陡峭的区域更为显著。

常见原因：

• 光栅角度校准偏移；

• 光源能量衰减导致检测峰值误判；

• 温度变化引起机械膨胀或位移。

控制方法：

• 使用氧化钬（Holmium Oxide）或稀土滤光片进行波长校验；

• 定期执行仪器自检与波长校准；

• 保持实验室温度恒定在 20–25℃。

2. 光源能量不稳定

BioMate 采用氘灯与钨灯双光源系统。光源老化或电源波动将导致输出强度变化，从而引起基线漂移或吸光度噪声。

主要表现：

• 吸光度曲线不平滑；

• 同一样品测定结果波动；

• 在低吸光区信噪比下降。

解决措施：

• 每次开机后预热 15–20 分钟，确保光源稳定；

• 每半年检测灯源能量输出，必要时更换；

• 使用稳压电源系统减少电压波动。

3. 杂散光干扰

杂散光（Stray Light） 是非目标波长光进入检测器的现象，常见于光路反射或滤光片老化。

影响：

• 在高吸光度范围内导致实际吸收值偏低；

• 限制仪器的线性响应范围。

控制方法：

• 定期清洁光学镜片与光路窗口；

• 使用 NaNO₂ 或 KCl 溶液检测杂散光水平；

• 保持样品舱清洁，避免反射面污染。

4. 检测器线性偏差

检测器（硅光二极管）的响应应与入射光强度成正比。当信号过强或过弱时，会出现非线性响应。

解决策略：

• 确保样品吸光度在 0.2–1.0 A 范围内；

• 对高浓度样品进行稀释；

• 避免测量高强光或强反射样品。

四、样品与比色皿误差

1. 比色皿匹配误差

比色皿透光面的平行度、光程长度及光学一致性直接影响吸光度。不同批次比色皿间的差异可能高达 ±0.005 A。

建议措施：

• 使用成对比色皿并固定放置方向；

• 定期检测比色皿透光一致性；

• 清洁后保持干燥，避免残留液滴形成光学干扰。

2. 样品气泡与悬浮物

气泡会造成局部光散射，使透过光强不稳定；悬浮颗粒则引入杂散反射。

排除方法：

• 加样后检查比色皿内是否有气泡，必要时轻拍或抽吸；

• 对浑浊样品进行过滤或离心；

• 采样后立即测定，避免沉淀生成。

3. 样品浓度与稀释误差

若样品浓度过高导致吸光度超过线性范围，测量结果将偏低。反之，过稀样品则信号接近噪声。

解决方案：

• 通过预实验确定最佳浓度范围；

• 使用精密移液器保证稀释比例准确；

• 在实验记录中注明稀释倍数以便回算。

五、操作与人为误差

1. 空白校正不当

空白液成分应与样品溶剂完全一致，否则会引入背景吸收误差。
若空白校正时比色皿方向与样品测量时不同，也会导致偏差。

校正规范：

• 使用相同溶剂及比色皿进行空白测量；

• 空白校正后不得改变波长与测量模式；

• 若更换溶剂，应重新执行基线校准。

2. 比色皿放置偏差

比色皿倾斜或光路未居中，会造成透光率偏差。
BioMate 的样品舱设计虽具有定位槽，但操作员仍需确认比色皿完全贴合。

3. 操作节奏与测定时间

部分反应体系具有时间依赖性，例如酶反应或光敏样品。若测定时间间隔过长，吸光度将随时间变化。

建议操作：

• 设定固定测量节奏；

• 使用自动采样器或时间扫描模式；

• 对易变样品，提前记录反应速率。

4. 温度波动

温度对吸收光谱的影响主要体现在溶液折射率与反应平衡常数变化。
温度波动超过 ±2℃，可能导致吸光度漂移。

控制策略：

• 使用恒温样品架或水浴控温；

• 避免在靠近热源的环境下操作；

• 对需长时间扫描的实验，应记录温度变化。

六、数据与计算误差

1. 线性回归偏差

在定量分析中，标准曲线的线性拟合不当会导致浓度计算偏差。

改进方法：

• 标准浓度覆盖样品范围；

• 排除异常点后重新拟合；

• 采用最小二乘法计算回归方程，并记录 R2R^2R2 值，要求 ≥0.999。

2. 小数位与取整误差

BioMate 显示数据通常保留 3 位小数，若人工计算时取整过早，会带来累计偏差。

建议：

• 在数据处理阶段保留至少 4 位有效数字；

• 仅在报告中进行四舍五入。

3. 软件算法误差

部分计算功能（如峰值识别或自动积分）依赖算法参数。若信噪比低或曲线不平滑，系统可能误判峰值位置。

避免方法：

• 在软件中启用“平滑”和“峰确认”功能；

• 手动核对关键波长处的吸光值；

• 对重要实验数据进行人工复算。

七、环境因素对误差的影响

1. 电磁干扰

实验室中如有大型设备（离心机、电机、超声清洗机等）运行，会产生电磁干扰，影响检测器信号稳定性。

解决措施：

• 将分光光度计单独供电；

• 使用屏蔽插座与接地系统；

• 避免仪器与高功率设备同处一电路。

2. 湿度与灰尘

光学元件表面若附着灰尘或受潮，会造成散射与透光率下降。

防控方法：

• 环境湿度控制在 50% 左右；

• 长期不用时加盖防尘罩；

• 定期用无水乙醇清洁光窗与反射镜。

3. 光线干扰

外界强光或反射进入样品舱，会改变背景光强。
BioMate 采用密闭式样品舱设计，但若舱门未完全关闭，仍会影响结果。

注意事项：

• 测量时确认舱门闭合；

• 避免强光直射仪器表面。

八、误差量化与统计分析

1. 重复性检验

通过同一样品多次测量，计算标准偏差（SD）与相对标准偏差（RSD%）：

RSD=SDA‾×100%RSD = \frac{SD}{\overline{A}} \times 100\%RSD=ASD×100%

若 RSD < 1%，说明仪器重复性良好。

2. 精密度评估

在不同时间或不同操作员条件下重复测量，比较数据差异，以评估操作稳定性。

3. 准确度验证

使用标准物质或已知浓度样品测定，与理论值比较：

偏差(%)=测定值−标准值标准值×100%偏差(\%) = \frac{测定值 - 标准值}{标准值} \times 100\%偏差(%)=标准值测定值−标准值×100%

偏差应控制在 ±2% 范围内。

4. 误差溯源与修正

若发现系统性偏差，应追溯光源能量、波长校准及样品制备步骤，逐项排查。必要时可通过软件进行修正系数调整。

九、减少误差的综合措施

1. 仪器管理制度化

• 建立操作规程（SOP）；

• 每季度进行性能验证；

• 所有校准结果记录备案。

2. 样品处理标准化

• 样品溶液配制采用分析纯试剂与高纯水；

• 严格控制稀释比例与温度；

• 样品测量顺序一致，减少时间影响。

3. 数据处理规范化

• 使用原始数据进行计算，不随意取整；

• 对异常值进行统计剔除；

• 报告中注明校准日期、标准曲线方程及测量条件。

4. 维护保养程序化

十、典型误差案例分析

案例一：吸光度值偏高

现象：样品吸光度比理论值高 10%。
原因：比色皿外壁有水滴或指纹导致光线散射。
改进措施：清洁比色皿外壁并重新测量。

案例二：曲线线性差

现象：标准曲线相关系数 R² = 0.992。
原因：部分标准溶液浓度配制不准。
改进措施：重新配制标准溶液并校准移液器。

案例三：波长漂移

现象：同一样品在不同时间测得吸光度差异较大。
原因：仪器温度波动引起光栅偏移。
改进措施：使用恒温装置，运行前预热。