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一、前言

吸光度测量是光谱分析中最常见、最基本的检测方法之一。通过测定物质对不同波长光的吸收强度，可实现物质定性识别与定量分析。赛默飞（Thermo Fisher Scientific）旗下的 BioMate 系列分光光度计 具备高精度光学系统、稳定的双光源配置与智能化软件算法，在吸光度测量中表现出优异的重复性与准确性。

本文系统介绍 BioMate 分光光度计在吸光度测量中的原理、操作流程、参数设置及误差控制方法，帮助用户掌握标准化测量流程，确保实验结果科学可靠。

二、吸光度测量的理论基础

1. 光吸收原理

当一束光照射到样品溶液中时，溶质分子会选择性吸收特定波长的光能。被吸收部分的光强减少，而未被吸收的部分透过样品进入检测器。

透射光强 $I$ 与入射光强 I0I_0I0 的比值称为透过率 $T$：

T=II0T = \frac{I}{I_0}T=I0I

吸光度 $A$ 定义为：

A=−log⁡10T=log⁡10I0IA = -\log_{10}T = \log_{10}\frac{I_0}{I}A=−log10T=log10II0

吸光度与样品浓度 $C$ 及光程长度 $b$ 之间遵循朗伯–比尔定律：

$$A=\epsilon bC$$

其中 $\epsilon$ 为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹），代表物质在特定波长下的吸收能力。

2. 吸光度与浓度的线性关系

在一定浓度范围内，吸光度与浓度呈线性关系。利用标准溶液绘制吸光度–浓度曲线，即可实现定量分析。当浓度过高时，由于分子间相互作用或散射效应，线性关系可能偏离，需要稀释样品后重新测定。

三、BioMate 吸光度测量系统概述

1. 光学结构

BioMate 采用 单光束或双光束光学系统：

• 光源：氘灯用于紫外区（190–350 nm），钨卤素灯用于可见区（350–1100 nm）；

• 单色器：采用高精度光栅系统分离波长；

• 样品舱：可容纳多种规格比色皿，具有恒温控制功能（部分型号）；

• 检测器：硅光二极管阵列，信号响应快、噪声低。

2. 软件功能特点

• 自动波长校准与光源切换；

• 多模式测量（单波长、多波长、时间扫描、定量分析）；

• 实时显示吸光度、透过率与浓度；

• 支持多格式数据导出与报告生成。

四、样品准备与空白校正

1. 样品要求

• 样品必须澄清透明，无悬浮颗粒或气泡；

• 若样品含微量杂质，应经离心或过滤处理；

• 浓度应控制在吸光度范围 0.2–1.0 A 之间，超出此范围应适当稀释。

2. 比色皿的选择与清洁

比色皿使用前需以蒸馏水或乙醇清洗，擦拭时应用镜头纸或无尘布，确保透光面无指纹与水迹。

3. 空白校正

空白液应与样品溶剂完全一致，仅不含分析组分。
在测量前应将空白液加入比色皿，放入样品舱中，点击“Blank”键，仪器自动将透过率设为100%（吸光度为0），为后续样品测定提供基准。

五、吸光度测量流程

1. 仪器开机与初始化

1. 打开电源，系统自动执行自检；

2. 检查光源状态与温度是否正常；

3. 完成自检后进入主界面，系统显示“Ready”；

4. 光源预热 15–20 分钟，保证输出稳定。

2. 模式选择与参数设置

在主界面中选择“Fixed Wavelength Mode”模式，设置：

• 测定波长（如 280 nm、600 nm 等）；

• 数据显示单位（A 或 %T）；

• 测量延时与重复次数（可设定平均值计算）。

3. 样品测量步骤

1. 先测量空白液，完成基线设定；

2. 将样品溶液加入比色皿（体积约占2/3）；

3. 将比色皿放入样品槽中，光学面朝向一致；

4. 点击“Measure”，系统立即显示吸光度数值；

5. 若为多个样品，可使用批量模式逐个测量。

4. 多波长吸光度测定

BioMate 支持多波长模式，可同时在2–5个波长下测定吸光度。
适用于多组分混合溶液分析或样品特征峰验证。
操作步骤：

• 在“Multi-Wavelength Mode”输入多个波长；

• 系统依次自动切换波长并测量；

• 测量结果以表格形式显示并可导出。

六、吸光度数据的计算与处理

1. 吸光度与透过率转换

系统自动根据测定值计算：

A=−log⁡10(T)A = -\log_{10}(T)A=−log10(T)

例如，当透过率 $T=50\%$ 时，吸光度 $A=0.301$。

2. 浓度计算

若已知样品的摩尔吸光系数 $\epsilon$ 与光程 $b$，可通过以下公式计算浓度：

C=AεbC = \frac{A}{ε b}C=εbA

当使用标准曲线法时，系统自动根据方程计算未知样品浓度。

3. 多组样品统计

仪器可计算：

• 平均吸光度；

• 标准偏差（SD）；

• 相对标准偏差（RSD%）。
  数据可导出至 Excel 进行进一步分析。

七、常见吸光度测量类型

1. 定性分析

通过扫描样品的全波段吸收光谱，确定其特征吸收峰，以识别化合物或评估纯度。
例如，蛋白质在 280 nm 处有特征吸收峰，核酸在 260 nm 处吸收最强。

2. 定量分析

基于朗伯–比尔定律，通过标准曲线法测定未知样浓度。
实验步骤：

1. 配制不同浓度标准溶液；

2. 测量吸光度并绘制曲线；

3. 求得回归方程 $A=kC+b$；

4. 代入未知样吸光度求解浓度。

3. 动力学测定

在固定波长下连续测定吸光度随时间变化的曲线，用于研究反应速率。
系统自动记录吸光度–时间曲线，并计算斜率或速率常数。

八、吸光度测量误差与控制

1. 仪器误差

2. 操作误差

• 比色皿放置方向不一致；

• 样品气泡未清除；

• 空白液选择错误；

• 稀释比例计算不准确。

为减少误差，应保持比色皿方向固定，严格执行空白校正并做好稀释记录。

3. 样品误差

• 溶液浑浊导致光散射；

• 样品氧化、降解或反应不完全；

• 温度波动影响吸收系数。

可通过过滤、恒温控制与即时测量减少影响。

九、BioMate 吸光度测量的应用示例

1. 核酸定量

• 波长选择：260 nm（核酸吸收峰）；

• 纯度评估：A260/A280 比值在 1.8–2.0 为高纯核酸；

• 浓度换算公式：

  C(μg/mL)=A260×50C (\mu g/mL) = A_{260} \times 50C(μg/mL)=A260×50

2. 蛋白质测定

• 波长选择：280 nm；

• 吸收来源：色氨酸、酪氨酸残基吸收；

• 线性范围：0.1–1.5 mg/mL；

• 可用于快速检测溶液蛋白浓度与纯度。

3. 化学比色反应

用于测定离子或化合物浓度，如 Fe³⁺–邻菲罗啉络合物在 510 nm 处有最大吸收峰。通过显色反应可实现痕量元素的比色分析。

十、数据保存与报告生成

1. 数据存储

测量数据可保存在内部存储器或外部 USB 设备中。文件格式包括：

• CSV（可编辑数据）；

• PDF（正式报告格式）；

• PNG/BMP（光谱图像）。

2. 报告生成

BioMate 可自动生成实验报告，包含：

• 测定模式与参数；

• 样品编号与吸光度结果；

• 标准曲线与回归方程；

• 操作者与日期信息。

报告可直接打印或导出，用于科研记录或质量管理。

十一、维护与校验建议

1. 每日维护

• 使用前后清洁比色皿与样品舱；

• 开机后预热光源 15 分钟；

• 结束后关闭光源再断电。

2. 定期校验

定期校验能确保吸光度测量精度长期保持在规范范围内。

十二、安全注意事项

1. 操作时避免液体溅入光学舱，防止损坏光学组件；

2. 光源运行时禁止打开光学舱盖，以免紫外光灼伤；

3. 使用有机溶剂样品时，应在通风良好的环境中操作；

4. 测定结束后应及时清理残液与废弃物；

5. 长时间停机时，关闭电源并加盖防尘罩。

十三、结果可靠性与数据质量保障

1. 重复性测试

同一样品连续测定 5 次，计算相对标准偏差（RSD），应小于 0.5%。

2. 线性验证

用标准溶液系列绘制标准曲线，线性相关系数 R2R^2R2 应 ≥ 0.999。

3. 对比验证

与已知标准仪器或外部检测结果进行比对，偏差不应超过 ±2%。

这些措施确保吸光度结果的准确性与可追溯性。