赛默飞分光光度计BioMate样品准备
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一、前言
在分光光度分析中，样品的准备质量直接决定测定结果的准确性与重现性。
赛默飞（Thermo Fisher Scientific）推出的 BioMate 系列分光光度计 具备高灵敏度和宽光谱响应范围，能够实现从紫外到可见光的精确测量。然而，即使仪器性能优异，若样品准备不当，也会导致吸光度异常、光谱畸变或定量结果偏差。
因此，建立标准化、系统化的样品准备流程，是保证实验数据可靠性的关键环节。本文将详细介绍使用 BioMate 进行紫外可见光谱分析时的样品准备方法与注意事项，内容涵盖样品采集、预处理、稀释、溶剂选择、比色皿使用、空白对照与保存管理等。
二、样品准备的总体原则
1. 清洁、均匀与稳定
样品应清洁无杂质、组分均匀、性质稳定。任何悬浮颗粒、气泡或沉淀都会导致光散射，从而影响透光率与吸光度读数。
2. 与实验目的匹配
不同类型实验（定性、定量、动力学研究等）对样品浓度、体积、纯度和溶剂的要求不同。准备前应明确测定目标和波长范围，选择合适的处理方案。
3. 可重复性原则
样品的制备过程应可复制、可追溯，包括使用相同浓度标准溶液、相同批次试剂和一致的稀释方法。
三、样品采集与储存
1. 样品采集要求
代表性：采样应能反映整体样品的特征，避免分层或局部浓度偏高。
污染控制：使用洁净器具，防止油脂、灰尘及有机物污染。
避免光照降解：对光敏物质，应在避光条件下采样与保存，如用棕色瓶或铝箔包裹。
2. 样品储存条件
| 样品类型 | 推荐储存条件 | 说明 |
|---|---|---|
| 有机溶液样品 | 密封避光，低温（4℃）保存 | 防止挥发或氧化 |
| 水溶液样品 | 常温避光，短期使用 | 超过24小时需重新制备 |
| 生物样品 | -20℃ 冷冻保存 | 防止蛋白质或核酸降解 |
3. 储存容器选择
使用具良好化学惰性的容器：
玻璃瓶用于一般化学溶液；
聚丙烯或聚四氟乙烯容器用于强酸、强碱或有机溶剂；
棕色试剂瓶用于光敏化合物。
四、样品预处理步骤
1. 过滤
过滤可去除悬浮颗粒与不溶杂质，是光谱分析的基本步骤。
常用滤膜规格：
0.45 μm 微孔膜（一般溶液）；
0.22 μm 微孔膜（高精度要求或核酸、蛋白样品）。
过滤时应注意：
使用一次性滤器或注射式过滤器；
过滤前预冲洗滤膜以去除溶出物；
若样品含易吸附组分，可选低吸附型滤膜材料。
2. 离心
对于含有微粒或沉淀的样品，应先离心分离。
一般条件：
转速：3000–8000 rpm；
时间：5–10 分钟；
温度：根据样品性质选择（如蛋白质保持在 4℃）。
离心上清液取用时应避免扰动底部沉淀。
3. 脱气
溶液中若存在气泡，会导致光路不稳定。可采用以下方法脱气：
超声震荡脱气；
真空脱气；
加热冷却法（轻微加热后自然冷却）。
五、溶剂与稀释液选择
1. 溶剂要求
高纯度：分析级或光谱级溶剂，确保背景吸收低；
低杂质吸收：溶剂自身在目标波长范围内应几乎无吸收；
与样品兼容：应保证样品稳定、不沉淀、不反应。
常用溶剂与适用波段示例如下：
| 溶剂 | 适用波段 (nm) | 说明 |
|---|---|---|
| 蒸馏水 | 200–800 | 最常用，低背景吸收 |
| 乙醇 | ≥210 | 有机溶液体系 |
| 甲醇 | ≥205 | 紫外测定常用 |
| 异丙醇 | ≥220 | 非极性溶质溶解良好 |
| 缓冲液 | ≥230 | 生化分析常用 |
2. 稀释操作
稀释时应选用洁净移液器，避免使用受污染容器。稀释倍数应使吸光度落在仪器线性范围内（0.2–1.0 A）。
若需大倍数稀释，建议逐级稀释以减小误差。
六、比色皿准备与使用
1. 材质选择
| 类型 | 材质 | 适用波段 | 特点 |
|---|---|---|---|
| 石英比色皿 | 石英玻璃 | 190–1100 nm | 透紫外性能优异 |
| 光学玻璃比色皿 | 光学玻璃 | 350–900 nm | 适用于可见光区 |
| 塑料比色皿 | 聚丙烯或聚苯乙烯 | ≥400 nm | 一次性使用，方便快速分析 |
2. 清洁与维护
使用前以蒸馏水或乙醇清洗，擦拭时使用镜头纸；
禁止使用含氨、酸或碱的清洗剂，以防腐蚀光学面；
若出现划痕、浑浊或残留，应更换新比色皿。
3. 样品加注
加样体积应保证液面高于光路中心线，一般控制在比色皿容量的 2/3。
加样后检查是否存在气泡，若有，应轻轻拍击或使用吸头排除。
4. 放置与定位
比色皿放入样品槽时，应保持透光面朝向一致。BioMate 的光路水平设计要求比色皿底部贴合支架，避免倾斜。
七、空白对照与标准样配置
1. 空白液的定义
空白液用于消除溶剂本身的吸收和杂散光影响，其组成应与样品溶液完全相同，仅不含分析组分。
2. 空白校正操作
将空白液装入比色皿；
选择“Blank”功能，系统自动将透过率设为100%（或吸光度0）；
随后放入样品比色皿测定吸光度。
3. 标准溶液制备
对于定量分析，应配置不同浓度的标准溶液。
要求：
使用同一批次溶剂；
浓度梯度均匀分布；
溶液应在测定当天配制完成。
八、样品浓度与测量范围控制
1. 吸光度范围
BioMate 的最佳线性范围为 0.2–1.0 A。超出此范围会导致响应偏离线性关系。
2. 浓度调整策略
若吸光度 >1.5 A，应适当稀释；
若吸光度 <0.1 A，可增加样品浓度或延长光程；
稀释倍数记录应准确，以便计算真实浓度。
3. 朗伯–比尔定律检验
可通过标准系列验证吸光度与浓度的线性关系，确保数据可靠。
九、特殊样品处理策略
1. 悬浊液与胶体
对于易散射光的样品，可采用以下方法：
低速离心或过滤；
采用积分球附件测定总透射光；
使用参考比色皿进行双光束补偿。
2. 生物样品
蛋白质、核酸等生物样品应在低温下制备并尽快测定。若含有缓冲盐或表面活性剂，需确认其在目标波段内不干扰测量。
3. 有机溶剂体系
有机溶液易挥发，应使用密闭比色皿。操作过程中避免高温和强光照射，以防溶剂蒸发导致浓度变化。
十、样品保存与稳定性
1. 短期保存
若测定间隔较短（数小时内），可将样品置于避光环境下静置保存。若为易氧化物，可加入少量惰性气体覆盖。
2. 长期保存
可采用以下方法延长稳定性：
冷冻保存（-20℃）；
加入抗氧剂（如 BHT 或亚硫酸盐）；
分装存放，避免反复冻融。
3. 稳定性测试
通过定时测量样品吸光度变化，可判断其化学或物理稳定性。
若变化超过 ±5%，则说明样品已发生降解。
十一、污染防控与交叉干扰
1. 实验室环境要求
保持操作台清洁干燥，避免溶剂蒸汽或粉尘污染。BioMate 的样品舱内禁止存放液体瓶或试剂。
2. 实验器具专用化
不同样品类别应使用独立移液器头、比色皿与储液瓶，防止交叉污染。
3. 玻璃器皿清洗流程
先用洗液（稀中性洗涤剂）清洗；
用自来水冲洗后再以蒸馏水漂洗三次；
用乙醇擦拭并晾干。
十二、常见问题与排查
| 问题现象 | 可能原因 | 解决措施 |
|---|---|---|
| 吸光度读数不稳定 | 比色皿外壁有水珠或气泡 | 擦拭干净并重新加样 |
| 光谱曲线异常起伏 | 样品混浊或含颗粒 | 过滤或离心处理 |
| 吸光度偏高 | 溶液浓度过大或溶剂吸收 | 稀释样品或更换溶剂 |
| 吸光度偏低 | 光程短或样品浓度过低 | 增加光程或提高浓度 |
| 样品重复性差 | 比色皿放置不一致 | 统一方向并标记位置 |
十三、样品记录与数据追踪
每次样品准备应记录以下信息：
样品编号与制备日期；
溶剂种类与批号；
稀释倍数与原液浓度；
操作人员与实验条件；
储存方式与时间。
这些记录可存入实验日志或电子数据管理系统，便于后期追踪与质量分析。
十四、BioMate 仪器优化建议
样品舱温度保持恒定：温度波动会导致吸收系数变化，可使用配套温控附件。
使用匹配比色皿组：比色皿光学差异小于 ±0.001 A，可提高重复性。
定期清洁光学窗口：防止残留溶剂或灰尘影响测光精度。
预实验测试浓度：通过初步扫描确认最佳波长与浓度范围。
