赛默飞分光光度计BioMate样品测定
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一、概述
赛默飞（Thermo Scientific）BioMate 系列分光光度计是一款用于紫外-可见光（UV-Vis）吸收分析的高性能仪器，可精确测定液体样品的吸光度、透射率与浓度。其设计目标是实现研究级精度与日常操作的便捷结合。
在科研与教学实验室中，BioMate 被广泛用于核酸、蛋白质、细胞生长、酶动力学、比色反应以及标准曲线测定等工作。样品测定的准确性取决于样品准备、光路校准、空白对照、波长选择以及数据分析的正确执行。
二、样品准备与基本原则
2.1 样品类型与适用性
BioMate 主要测定透明液体溶液的吸收特征。典型样品包括：
核酸（DNA、RNA、寡核苷酸）
蛋白质溶液（纯化物或粗提液）
细胞悬液（用于 OD 测定）
比色反应产物（Bradford、BCA、Lowry、NBT、ABTS 等）
化学溶液（配合物、染料、药物、化学标准品）
浑浊、含颗粒或强散射样品会造成结果偏差，应通过离心、过滤或稀释处理。
2.2 比色皿与光程
标准比色皿光程为 10 mm（1 cm）。低浓度样品可使用长光程池（20-100 mm），高浓度样品可使用短光程池（1-5 mm）。
池材质应根据波长选择：
石英池：190-1100 nm，全波段通用。
玻璃池：340 nm 以上。
塑料池：400 nm 以上（一次性使用）。
比色皿应洁净、无指纹、无水迹，测定时方向一致，外壁擦干后放入样品架。
2.3 空白与对照设置
空白用于校零或背景扣除，应与样品使用相同溶剂、缓冲液、浓度条件。
若样品中有添加剂（如盐、缓冲液、表面活性剂），空白中也必须等量加入。
对于多组分体系，可采用双空白：溶剂空白 + 反应试剂空白，以分离溶剂吸收和反应背景。
2.4 样品浓度与线性范围
BioMate 的吸光度测量线性通常在 0.1–2.0 A。超过此范围信号可能饱和。
对于高浓度样品，使用短光程池或稀释样品。
对于低浓度样品，使用长光程池或浓缩样品。
稀释倍数必须记录在实验日志中，用于计算最终浓度。
三、样品测定的通用流程
仪器预热与自检
开机后等待灯源稳定，系统完成初始化。检查波长、光度校准状态正常。安装比色池架或自动换样器
选择适合样品数的样品架（单池、三池、六池、八池等），确认池位清洁。空白测定
将空白溶液置入池中，执行“Measure Blank”或“Set Zero”命令，设定零点或参比。样品测定
置入样品池，选择测量模式（吸光度、透射率、浓度、动力学、扫描等），输入所需波长，执行测量命令。数据读取与保存
屏幕显示吸光度、透射率或计算后的浓度。可将数据导出、打印或存储。结果校验
若样品浓度过高导致吸光度超出线性范围，需重新稀释并重复测量。
四、常见测定类型
4.1 核酸样品测定
(1) 测定原理
核酸在 260 nm 处有最大吸收峰，蛋白质在 280 nm，酚类等有机物在 230 nm 也有吸收。利用这些波长的吸光度及其比值，可判断核酸浓度和纯度。
(2) 操作步骤
选择“DNA/RNA”模式。
用 TE 缓冲液或去离子水作空白。
在 260 nm 测量吸光度，仪器自动计算浓度（基于 A260=1 对应的浓度系数）。
同时测定 280 nm 与 230 nm 吸光度，计算 A260/A280 和 A260/A230。
(3) 数据解释
DNA 纯度：A260/A280≈1.8
RNA 纯度：A260/A280≈2.0
A260/A230 应在 2.0–2.2；若偏低，提示盐、酚或碳水化合物污染。
(4) 注意事项
核酸样品应无气泡，稀释比例准确；使用石英池；测定后立即清洗，防止残留。
4.2 蛋白质样品测定
(1) 直接 UV 法
基于芳香族残基（Trp、Tyr、Phe）在 280 nm 的吸收。
操作：
选择“Protein A280”模式。
使用相同缓冲液作空白。
测量吸光度后输入吸收系数（ε）或使用默认系数。
优点：快速、无需试剂；缺点：对混合物特异性差。
(2) 比色法
BioMate 内置 Bradford、Lowry、BCA、Biuret 等方法。
操作步骤：
制备不同浓度标准蛋白（如 BSA）。
添加比色试剂，反应显色。
测量标准系列吸光度，建立标准曲线。
测量未知样品吸光度，由曲线求得浓度。
此类方法特异性高，适用于复杂体系蛋白定量。
4.3 细胞生长测定（OD600）
(1) 原理
细胞悬液对光的散射造成透射光减弱，其“表观吸光度”与细胞浓度成比例。常以 600 nm 为监测波长。
(2) 操作
选择“Cell Growth”模式。
以培养基为空白。
测量样品吸光度（OD600）。
根据校准曲线或经验公式，将 OD 转换为细胞数或浓度。
(3) 注意事项
样品应均匀混匀，避免沉降。
若 OD>1，应稀释至线性范围。
采用一次性塑料池时应保持同一批次，以减小误差。
4.4 比色反应测定
(1) 原理
许多化学或生化反应产生有色化合物，其吸光度与产物浓度成比例。BioMate 通过固定波长测吸光度来计算产物量或反应程度。
(2) 应用实例
酶促反应：底物转化为有色产物（如 NADH 生成，340 nm）。
化学分析：铁-邻菲罗啉络合物（510 nm）、铬酸盐比色、氨氮测定等。
药物定量：活性成分比色分析。
(3) 操作要点
选择波长（根据产物 λmax）。
准备反应体系和空白对照。
反应终止或恒温测定吸光度。
使用标准曲线或摩尔吸光系数计算浓度。
4.5 动力学测定
(1) 原理
在恒定温度与反应条件下，记录样品吸光度随时间的变化。
通过计算初始线性阶段斜率（ΔA/Δt），获得反应速率。
(2) 操作步骤
选择“Kinetics”模式。
设定波长、采样间隔、总时间。
加入样品立即启动测量。
仪器自动绘制 A-t 曲线，并计算反应速率。
(3) 应用领域
酶促反应活性测定。
化学反应速率研究。
反应动力学参数（Km、Vmax）分析。
(4) 注意事项
反应应在温控条件下进行；溶液体积充足避免气泡；采样时间间隔根据反应速率调整。
4.6 标准曲线测定
(1) 原理
建立吸光度与已知浓度间的线性关系，用于未知样品定量。
(2) 操作步骤
配制系列标准溶液。
测量各标准的吸光度，输入对应浓度。
仪器绘制标准曲线，显示方程（A=kc+b）及相关系数 R²。
测量未知样品吸光度，自动换算浓度。
(3) 注意事项
标准溶液应新鲜配制、混匀无气泡；R² 应接近 1.0（>0.99）；标准与未知样品应在相同条件下测定。
五、波长扫描与多波长测定
5.1 全谱扫描
设置起止波长（如 200–800 nm），步长 1 nm，仪器自动扫描生成光谱图。
用于未知样品吸收峰确定。
可识别混合物中不同成分特征峰。
可判断样品光学纯度与结构变化。
5.2 多波长测定
在多个波长同时测量吸光度，可计算差值或比值。
例如：
核酸 A260/A280
染料混合体系双波长解析
背景扣除法（主峰波长减去参考波长）。
六、特殊样品与方法
6.1 低浓度样品
采用长光程池、提高光路强度或使用累积测量模式增加信噪比。
6.2 高吸收样品
稀释或使用短光程池。若吸光度仍过高，可选更长波长避开强吸收区。
6.3 温控样品
对于温度敏感反应（如酶、蛋白变性），可使用 Peltier 恒温池架维持 20-60 °C，并进行温度扫描测定。
6.4 微量样品
使用微量比色皿（0.5–2 µL），常见于核酸定量。应严格控制位置、气泡与清洁度。
七、数据处理与结果评估
吸光度至浓度换算
根据比耳-朗伯定律 A=εbcA = εbcA=εbc，可换算浓度。若未知 ε，可利用标准曲线或校准样本确定。比值与差值分析
A260/A280、A260/A230、A340–A405 等差值/比值有助于样品纯度与反应特异性分析。重复性与误差分析
多次测定同一样品，计算相对标准偏差（RSD），一般应 <2%。
若偏差大，应检查池清洁、样品均匀性或仪器漂移。数据导出与保存
BioMate 支持 USB、以太网、Wi-Fi 导出。数据保存应包含测定日期、波长、光程、稀释倍数、方法参数。
八、质量控制与维护
8.1 校准与验证
波长准确度：每季度用标准滤光片校验。
光度线性：用中性密度滤光片或标准溶液检验。
噪声与漂移：空白连续测定 10 分钟，波动应在允许范围内。
8.2 样品池维护
每次测定后立即用去离子水冲洗，必要时用乙醇清洁，晾干存放。
8.3 灯源与光学系统
氙灯或氘灯寿命一般 2000-5000 小时。灯亮度下降时应更换；保持样品舱清洁、防尘防潮。
8.4 记录与追溯
实验日志应包含仪器编号、样品编号、方法、空白、波长、稀释倍数、操作者与时间，便于追溯与复现。
九、结果示例与解析
| 测定类型 | 波长（nm） | 结果表现 | 备注 |
|---|---|---|---|
| DNA 测定 | 260 | A=0.95 → 47.5 µg/mL | 纯度良好 A260/A280=1.85 |
| 蛋白 UV 法 | 280 | A=0.72 → 0.36 mg/mL | 无显著背景 |
| Bradford 法 | 595 | A=0.43 → 0.42 mg/mL | R²=0.998 |
| 细胞生长 | 600 | OD600=0.85 | 对应约 8×10⁸ cells/mL |
| 酶动力学 | 340 | ΔA/min=0.062 | 酶活性计算依据 ε=6220 M⁻¹cm⁻¹ |
结果报告可按吸光度、浓度、速率、比值分类输出。
十、常见问题与排查
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 吸光度不稳定 | 灯源预热不足、池有气泡 | 预热10 min、重新装样排泡 |
| 空白校正失败 | 溶剂不匹配或池污染 | 更换空白、清洗比色皿 |
| 吸光度过高 | 样品太浓或光程太长 | 稀释或换短池 |
| 测量漂移 | 温度变化、仪器漂移 | 恒温操作、重新校零 |
| 波长偏差 | 光栅校准失准 | 运行波长校验或联系维护 |
| 重复性差 | 样品混匀不充分 | 混匀后快速测定 |
十一、应用拓展
BioMate 样品测定不仅限于生物分子。以下为部分拓展应用：
药物分析：测定溶出度、药物含量、降解产物。
环境样品：检测氮、磷、金属离子比色反应。
食品与饮料：监测色素、酚类、抗氧化能力。
材料研究：分析纳米粒子表面等离子吸收峰。
教学实验：展示光吸收原理与比耳-朗伯定律。
