赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 FL Automated Cell Counter荧光信号分析

该仪器配备三通道高灵敏度荧光检测系统（Blue、Green、Red），可实现多种荧光标记样品的定量与定性分析，广泛应用于转染效率检测、细胞活性分析、蛋白表达监控、细胞群体分型及药物反应研究等实验。

产品详细

质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

荧光信号分析是赛默飞Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪的核心功能之一。
该仪器配备三通道高灵敏度荧光检测系统（Blue、Green、Red），可实现多种荧光标记样品的定量与定性分析，广泛应用于转染效率检测、细胞活性分析、蛋白表达监控、细胞群体分型及药物反应研究等实验。

荧光信号分析的精度直接决定实验结果的可靠性。Countess 3 FL 利用高分辨率光学系统与智能图像算法，将荧光信号采集、校正、识别和统计分析集成于自动化流程中，实现从样品加载到结果输出的全程定量化。

二、荧光检测系统组成

1. 光源系统

仪器采用高稳定性固态LED光源，分别对应三种主激发通道：

蓝光通道（Blue）：激发波长 405–488 nm，用于DAPI、Hoechst等染料；
绿光通道（Green）：激发波长 505–530 nm，常用于FITC、GFP、Calcein-AM等；
红光通道（Red）：激发波长 565–625 nm，用于PI、RFP、Texas Red等。

每个通道的LED光源均独立驱动，具有光强稳定、响应快、寿命长等特点，光强漂移低于±1%。

2. 滤光系统

荧光检测模块由精密滤光片与分光镜组合而成，确保激发光与发射光的有效分离。
滤光系统透射效率>90%，光谱选择性高，保证信号纯度，降低背景干扰。

3. 成像与检测模块

仪器内置2048×1536像素高灵敏度CMOS成像器，配合光学放大镜头捕获荧光图像。
系统动态范围宽，可在信号强弱变化较大的条件下仍保持线性响应。

三、荧光信号采集原理

荧光检测基于激发与发射光的物理特性。Countess 3 FL 的荧光分析过程可分为以下几个步骤：

激发阶段：
LED光源发出特定波长光照射样品，使荧光染料分子跃迁至激发态。
发射阶段：
染料分子从激发态返回基态时释放较长波长的光（发射光）。
分离与成像：
激发光被反射滤镜阻断，仅允许发射光进入成像通道；
发射信号由CMOS传感器捕获并转换为数字信号。
信号量化：
系统通过像素灰度值计算每个细胞的荧光强度；
软件算法自动识别阳性/阴性细胞，生成强度直方图与统计结果。

该检测原理结合多通道同步成像，可同时分析多种荧光标记，从而实现复杂细胞样品的多参数研究。

四、荧光信号处理与分析算法

Countess 3 FL 内置的荧光信号分析算法由赛默飞自主研发，具备信号识别、背景扣除、归一化与分类统计四大模块。

1. 背景扣除算法（Background Subtraction）

系统自动检测样品区域的平均背景强度，通过数值拟合实现信号校正：

背景采样面积可覆盖整个图像20%以上；
背景信号均值自动从每个像素灰度中扣除；
有效降低噪声并消除非特异性荧光影响。

2. 信号增强与去噪（Noise Reduction）

采用高斯滤波与自适应平滑算法，提升信噪比；
系统自动抑制散射光与热噪声，使低荧光强度信号也能清晰识别。

3. 阈值识别（Threshold Detection）

荧光阳性与阴性细胞的划分基于强度阈值判定：

系统可自动计算最优阈值（基于Otsu算法）；
用户也可手动调节阈值以适应不同染料特性。

4. 多通道信号融合（Channel Merging）

仪器支持三通道同步分析：

自动配准三通道图像，误差小于0.5 μm；
支持信号叠加（Overlay）显示，进行共表达分析。

5. 归一化与统计

为消除样品批次间光强差异，系统将荧光信号归一化至标准范围（0–255）。
软件自动输出：

平均荧光强度（Mean Intensity）；
信号分布直方图；
阳性细胞比例（Positive %）；
信号峰值（Peak Value）与宽度。

五、常见荧光染料与检测通道对应关系

通道	激发波长 (nm)	发射波长 (nm)	常用染料	典型应用
Blue	405–488	450–500	DAPI、Hoechst	细胞核染色
Green	505–530	515–560	FITC、GFP、Calcein-AM	转染检测、活性分析
Red	565–625	600–650	PI、RFP、Texas Red	死亡细胞检测、双染实验

Countess 3 FL 可同时开启三通道进行联合分析，实现多种生物标记共检测。

六、荧光定量分析

1. 阳性细胞比例

仪器自动统计荧光信号超过阈值的细胞数，并计算阳性细胞比例：

$\% = \frac{N_{fluorescent}}{N_{total}} \times 100$

其中 $N_{fluorescent}$ 为检测到的荧光阳性细胞数， $N_{total}$ 为总细胞数。

2. 平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）

系统根据每个细胞的像素灰度值计算平均信号强度，反映整体表达水平。
MFI值与蛋白表达量、基因转录活性或细胞反应强度高度相关。

3. 信号分布分析

仪器可输出荧光强度直方图，用于显示细胞群体的信号分布。

峰值偏移代表表达量变化；
分布宽度反映群体异质性。

4. 双荧光与多荧光分析

在双通道或三通道实验中，系统可进行信号重叠分析：

计算共表达比例（Double Positive %）；
绘制通道间强度相关曲线；
输出相关系数（R²）以评估信号协同程度。

七、典型应用场景

1. 转染与基因表达分析

使用GFP、RFP等报告基因标记时，Countess 3 FL 能直接识别阳性细胞比例与信号强度。
系统生成转染效率报告，包括：

阳性细胞百分比；
平均荧光强度（反映表达水平）；
分布直方图（反映表达均一性）。
该功能广泛应用于质粒转染、病毒感染及基因编辑实验。

2. 细胞活性与凋亡分析

通过Calcein-AM/PI双染实验，仪器可区分活细胞（绿色荧光）与死亡细胞（红色荧光）。
系统自动叠加图像并输出活性比例，为细胞培养质量评估提供参考。

3. 药物诱导信号通路研究

当细胞受到药物处理时，特定荧光探针可标记信号通路激活状态。
Countess 3 FL 通过多通道同步分析监测荧光变化，用于药理机制探索与剂量优化。

4. 干细胞与分化研究

在干细胞分化实验中，可利用荧光标记监控特异性蛋白表达变化。
仪器可定量分析不同阶段样品的阳性细胞比例，为分化效率评价提供数据支持。

5. 免疫细胞功能检测

荧光标记抗体可用于识别T细胞、B细胞或巨噬细胞亚群。
Countess 3 FL 可定量检测各亚群荧光信号强度差异，辅助免疫反应研究。

八、荧光信号的准确性与线性关系

1. 光学线性验证

荧光检测系统在1–10⁵光子计数范围内呈良好线性响应。
实验表明，不同浓度样品的平均荧光强度与染料浓度成正比（R²≥0.99）。

2. 信号稳定性

LED光源热漂移极低（<1%/h），确保长时间检测过程中荧光强度稳定。

3. 重复性验证

同一样品重复检测10次，荧光信号CV值低于3%，表明检测精度高、再现性优异。

九、荧光信号校准

为保证数据的可比性与长期稳定性，Countess 3 FL 提供多级荧光通道校准功能。

1. 标准样品校准

使用赛默飞官方荧光微球进行标准化：

插入标准样品后选择“Fluorescence Calibration”；
系统自动测量并调整通道增益与曝光参数；
保存校准曲线，确保每次检测光强一致。

2. 通道对齐校准

在多通道检测中，系统通过软件算法自动对齐图像，保证不同通道的空间一致性。

3. 时间漂移修正

若连续检测大量样品，系统会自动执行温度与光强漂移补偿，防止信号衰减或偏移。

十、数据输出与可视化

1. 实时图像显示

检测过程中可实时查看荧光通道与明场叠加图像；用户可调节亮度、对比度与伽马值。

2. 结果报告

系统自动生成报告，内容包括：

样品名称与时间戳；
各通道阳性比例；
平均与峰值荧光强度；
信号直方图与共表达图。

3. 数据导出

结果可导出为多种格式：

PDF：综合分析报告；
CSV/XLSX：定量数据；
TIFF/PNG：荧光图像；
兼容Thermo Fisher Connect云端存储。

十一、影响荧光信号的因素与优化建议

影响因素	影响表现	优化建议
染料浓度过高	信号饱和，背景增强	按推荐浓度稀释
染色时间不足	荧光信号弱	延长反应时间或使用新鲜染料
样品温度波动	荧光效率下降	保持室温稳定（20–25°C）
光源老化	光强降低	定期校准或更换LED模块
样品沉降	信号不均	检测前充分混匀
光学污染	背景噪声升高	清洁样品舱与透镜窗口

通过优化以上条件可进一步提升荧光信号质量与数据精确性。

十二、与传统荧光检测方法比较

方法	检测速度	定量精度	操作复杂度	应用范围
荧光显微镜	中等	高	高	定性观察
流式细胞仪	高	极高	较高	大规模分析
Countess 3 FL	快速（10秒/样品）	高（误差<3%）	简便	定量分析与筛选

Countess 3 FL 在保证高精度的同时，简化了操作流程，适用于日常实验室的快速定量分析。

十三、典型实验案例

案例一：GFP转染效率测定

样品：GFP质粒转染HEK293细胞
检测：Green通道检测荧光信号
结果：阳性细胞比例为82.6%，平均荧光强度325 a.u.
结论：转染效率高，信号分布均匀，可用于下游功能分析。

案例二：Calcein-AM/PI双染活性检测

样品：药物处理后的HeLa细胞
检测：Green通道（Calcein-AM）与Red通道（PI）
结果：活细胞比例72%，死细胞28%；
结论：药物具有中等毒性，适合进一步浓度优化。

案例三：双荧光共表达分析

样品：GFP-RFP共转染细胞
检测：Green与Red通道叠加分析
结果：共表达比例48%，荧光信号高度相关（R²=0.91）；
结论：载体共表达系统构建成功，表达协同性强。

十四、荧光信号分析在科研中的应用拓展

基因编辑验证：检测Cas9-GFP融合蛋白的表达情况；
免疫反应检测：分析特定抗体标记细胞的荧光分布；
药物筛选与机制研究：通过荧光探针评估信号通路激活水平；
细胞周期分析：结合DNA染料检测不同周期细胞比例；
凋亡研究：利用Annexin V与PI双染实现早期与晚期凋亡判别。

这些应用展示了Countess 3 FL 在荧光检测领域的广泛兼容性与科研价值。

编辑推荐

热门阅读