质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、实验流程概述

Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪是一款集明场成像、荧光检测与数据统计分析于一体的全自动细胞计数平台。
其实验流程围绕“快速制样、智能检测、精准分析、可追溯记录”四大核心展开，旨在在数分钟内完成从样本准备到数据输出的全流程分析。

仪器采用高分辨率 CMOS 成像系统、三通道荧光检测模块与自动算法分析技术，可适用于多种类型细胞（如悬浮细胞、贴壁消化后细胞、酵母、原代细胞等）的定量检测与活性评估。
整个实验流程标准化程度高，操作简单，用户仅需数步即可获得可靠的细胞计数、活死比例、荧光信号强度及形态信息。

二、实验准备阶段

1. 实验环境准备

• 确保仪器放置在水平稳固的实验台上，避免震动；

• 环境温度控制在 20–25°C，相对湿度低于 70%；

• 避免阳光直射或强光干扰，以防荧光信号波动；

• 启动仪器后预热 5 分钟，使光源稳定输出。

2. 试剂与耗材准备

常用耗材包括：

• Countess 专用一次性计数板（Countess Cell Counting Chamber Slide）；

• Countess 3 校准珠或标准细胞样品；

• AO/PI 双染液（Acridine Orange / Propidium Iodide） 或其他荧光染料；

• 移液枪与吸头；

• PBS 或无血清培养基（用于稀释细胞）。

3. 样品准备原则

• 样品应均匀悬浮，避免细胞沉淀或聚集；

• 建议细胞浓度控制在 1×10⁴ – 1×10⁶ cells/mL；

• 若样品浓度过高，可用培养基稀释；

• 对贴壁细胞需充分胰酶消化并混匀。

4. 染色准备

根据检测目的选择是否进行染色处理：

• 活死细胞检测：使用 AO/PI 双染液，按 1:1 体积比例混合样品；

• 转染效率或荧光蛋白分析：直接使用 GFP、RFP 或其他荧光标记细胞；

• 未染样品计数：采用明场模式进行检测。

染色后静置 2–3 分钟以确保染料与细胞充分结合。

三、仪器开机与系统设定

1. 启动与自检

按下电源键后，系统自动进入启动界面并执行以下自检过程：

• 检查光源强度与均匀性；

• 校验摄像头与自动聚焦模块；

• 检查存储空间与软件状态。
  若系统检测正常，主界面显示“Ready for Counting”。

2. 用户登录与样本信息录入

• 可选择直接登录或使用实验室账户；

• 在“Sample Info”界面输入样品编号、操作者、实验批次及备注；

• 系统自动生成样本时间戳与检测编号。

3. 模式选择

仪器提供三种工作模式：

用户可根据实验需求选择检测模式并激活对应通道（Green、Red、Far Red）。

四、上样与装载步骤

1. 样品上样

1. 使用移液枪取 10 µL 细胞悬液；

2. 将样品缓慢加入计数片中心孔中，避免气泡；

3. 若使用双染样品，轻轻混匀后立即上样。

2. 装载计数片

• 将计数片插入样品槽中，标识面朝上；

• 仪器自动识别载片并定位至成像区域；

• 屏幕显示样品图像预览。

五、成像与聚焦

1. 自动聚焦过程

系统自动扫描多个焦平面，通过计算清晰度函数 S(f)S(f)S(f) 选取最佳焦点：

S(f)=∑x,y∣∇If(x,y)∣S(f) = \sum_{x,y} |\nabla I_f(x, y)|S(f)=x,y∑∣∇If(x,y)∣

整个聚焦过程约需 2–3 秒。

2. 明场成像

自动聚焦完成后，仪器捕获高分辨率明场图像，用于细胞形态和数量分析。

3. 荧光通道成像

若启用荧光模式，系统将依次启动 Green、Red、Far Red 通道并分别采集图像：

• Green 通道：用于检测 FITC / AO / GFP；

• Red 通道：用于检测 PI / RFP；

• Far Red 通道：用于检测 Cy5 / APC 等远红染料。

每个通道的曝光时间与增益值可自动调整或手动设置，以获得最佳信号。

六、图像处理与数据分析

1. 图像预处理

系统自动执行以下图像优化步骤：

• 背景扣除（消除非均匀光照）；

• 噪声过滤（减少杂点干扰）；

• 灰度标准化（统一亮度范围）。

2. 细胞识别与计数

Countess 3 FL 采用基于边缘检测与形态学算法的识别系统，自动区分单个细胞与碎片。
主要算法流程：

1. 图像二值化与轮廓识别；

2. 边界追踪与细胞面积计算；

3. 聚集细胞分离（分水岭算法）；

4. 输出单细胞计数与统计结果。

3. 活死细胞分析

在双通道模式下（AO/PI），系统通过荧光强度比值判定：

• Green⁺ / Red⁻ → 活细胞；

• Green⁻ / Red⁺ → 死细胞；

• Green⁺ / Red⁺ → 凋亡或双阳性细胞。

算法实时生成活率（Viability %）并显示在统计面板中。

4. 统计结果计算

系统自动输出以下指标：

同时生成实时直方图与散点图用于数据可视化分析。

七、结果查看与可视化

1. 实时数据显示

检测完成后，系统自动生成统计结果窗口，用户可查看：

• 细胞总数与活率；

• 荧光强度分布图；

• 细胞尺寸分布曲线；

• 叠加图像（含边界标记与识别编号）。

2. 图像浏览功能

用户可自由切换通道图像（Brightfield、Green、Red、Far Red），或查看多通道叠加图。
放大功能支持单细胞级别观察。

3. 结果修正（可选）

若系统识别出现误差，用户可使用手动标记工具增删识别区域，系统实时更新统计结果。

八、数据保存与导出

1. 自动保存机制

检测完成后，所有结果自动保存至系统存储器中，包括：

• 图像文件（PNG/TIFF）；

• 数据文件（CSV）；

• 分析报告（PDF）；

• 元数据文件（JSON）。

2. 文件命名

系统自动按样本编号和日期生成文件名：

复制编辑HeLa_AO-PI_2025-10-30_14-35-21.csv

3. 数据导出方式

• USB 导出：通过前置 USB 3.0 接口直接导出全部结果；

• LAN / Wi-Fi 导出：同步至实验室服务器；

• Thermo Cloud：上传至云端账户进行远程存储与查看。

4. 报告内容

导出的 PDF 报告包含：

• 样本信息与检测参数；

• 明场与荧光通道图像；

• 统计表与图表；

• 操作者与仪器编号。

九、质量控制与重复性验证

1. 校准检查

建议每日首次使用前执行光源与聚焦校准，以确保成像一致性。

2. 重复性测试

• 使用标准微球样品重复测定 3 次；

• 计算标准差与变异系数（CV）；

• 若 CV < 5%，则系统精度合格。

3. 结果验证

对关键实验结果可通过显微镜手动计数验证，确保算法识别正确。

4. 系统维护

• 每周清洁样品槽与镜头窗口；

• 每月检查光源亮度与滤光片状态；

• 每季度更新软件与算法版本。

十、常见问题与解决方案

十一、实验流程优化建议

1. 控制样品浓度：过高会导致重叠识别困难；过低则信号不足。

2. 保持样品均匀性：在上样前轻轻混匀以减少偏差。

3. 校准曝光时间：不同染料与细胞类型需优化曝光以获得最佳信噪比。

4. 采用标准命名规则：便于后期数据管理与比对。

5. 定期清洁光学通道：保持图像清晰度与信号稳定性。

十二、扩展实验应用

1. 活死细胞检测

通过 AO/PI 双染分析细胞生存状态，计算活率和死亡率。

2. 荧光蛋白表达分析

在 GFP/RFP 通道下检测转染效率与共表达比例。

3. 免疫细胞计数

用于 PBMC、T细胞等悬浮细胞定量分析。

4. 药物敏感性实验

统计不同药物处理组细胞存活率，实现药效初筛。

5. 细胞生长曲线监测

通过多时间点测量样本浓度，绘制细胞生长曲线。

十三、数据管理与追溯

1. 自动记录系统

每次实验数据均附带：样本编号、检测时间、操作者、仪器序列号、软件版本，保证数据可追溯性。

2. 历史数据检索

用户可通过“Data Manager”模块按日期、样本名或操作者检索以往实验记录。

3. 数据安全机制

系统采用 AES-256 加密保存文件，防止篡改或误删。

十四、实验流程时间分配

该流程极大地提升了实验室工作效率，实现高通量、高一致性的数据获取。

十五、结果展示与科研应用价值

Countess 3 FL 的实验流程结合硬件与算法优势，使实验数据具备以下特征：

• 高精度：自动聚焦与光学校准保证识别准确性；

• 高重现性：标准化流程减少人为误差；

• 数据可溯源：所有操作均记录在案；

• 可扩展性强：适配多种细胞类型与染料体系。

科研人员可利用该流程快速获得：

• 活死细胞比例分析；

• 细胞浓度与生长曲线；

• 转染效率与表达比；

• 荧光信号定量结果。

这些数据不仅用于基础研究，也可作为质量控制和生产过程监测的重要参考。