赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 FL Automated Cell Counter校准方法
质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司
一、校准的必要性概述
Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪是一款集明场成像、荧光检测与自动分析于一体的高精度细胞分析设备。为了保证其在不同环境下长期稳定运行并维持数据一致性，定期校准是至关重要的环节。
校准（Calibration）指通过标准样品或内置算法，将仪器的光学、电子及图像识别系统调整至标准状态，使测量结果符合真实值或可溯源的参照值。
对于 Countess 3 FL，校准过程主要确保以下三方面：
光学聚焦准确 —— 保证图像清晰、边缘锐利；
荧光通道灵敏度一致 —— 各通道信号强度标准化；
计数算法精度可靠 —— 数据统计与真实细胞数量匹配。
通过科学的校准流程，可以有效减少仪器漂移、光源老化或使用环境变化对测量结果的影响，从而确保实验数据的准确性和可重复性。
二、校准体系结构与原理
Countess 3 FL 的校准体系由光学校准、荧光通道校准、算法校准与系统自检四个子模块组成。
| 校准类型 | 目的 | 关键参数 | 校准方式 |
|---|---|---|---|
| 光学聚焦校准 | 调整成像清晰度 | 焦距、对比度 | 自动/手动双模式 |
| 明场亮度校准 | 标定光源强度 | LED 光强、均匀性 | 内置传感器自检 |
| 荧光通道校准 | 校正信号灵敏度 | 激发/发射响应曲线 | 使用标准荧光微球 |
| 计数算法校准 | 优化识别阈值 | 识别精度、边缘检测 | 软件自动调整 |
| 全系统自检 | 确认模块功能正常 | 光源、摄像头、滤片 | 启动自检测程序 |
仪器的软件系统在校准过程中会自动读取传感器反馈数据，计算偏差并进行参数修正，以保证系统一致性。
三、校准准备与条件
在正式校准前，需确保以下条件满足：
仪器环境：温度 20–25°C，相对湿度 ≤70%，避免强光与震动。
样品要求：使用推荐的标准微球或已知浓度的细胞样品。
设备状态：清洁载样槽、镜头及计数片，无尘无水迹。
软件版本：确认系统为最新固件，以确保算法最优。
光源预热：开启仪器后静置 5 分钟，使 LED 光源达到稳定输出。
四、光学聚焦与明场校准
1. 自动聚焦校准
在“Settings → Calibration → Focus Calibration”中选择自动模式：
系统自动扫描焦平面范围（±200 µm）；
计算图像锐度指标（Sharpness Index）；
锁定最佳聚焦层面并记录焦距值。
该参数将作为后续样本成像的参考，确保每次成像焦距一致。
2. 明场亮度均一性校准
仪器内置亮度传感器，可检测 LED 光源输出的均匀度。
操作步骤：
插入空白计数片（无样品）；
选择“Brightfield Calibration”；
系统采集 5 张图像，分析灰度分布；
自动调整光源电流以实现均一照明（偏差 <3%）。
3. 手动微调校准
若自动聚焦结果不理想，可在“Manual Adjust”模式中微调焦距及亮度。
此功能适用于粘附性强或形态不规则的细胞样品。
五、荧光通道校准方法
1. 校准原理
荧光通道校准旨在确保不同通道的激发能量与检测灵敏度保持一致，以便多色实验中的信号比较具有科学性。
Countess 3 FL 采用三通道光学结构：Green、Red 与 Far Red，每个通道均需独立标定。
2. 校准样品选择
建议使用赛默飞专用 CountBright™ 荧光微球 或具有已知发射峰的标准颗粒：
| 通道 | 推荐标准 | 发射峰 (nm) | 应用 |
|---|---|---|---|
| Green | FITC 参考微球 | 519 | 活细胞信号基准 |
| Red | PE 或 PI 微球 | 617 | 死细胞信号基准 |
| Far Red | Cy5 或 APC 微球 | 670 | 深层信号校正 |
这些标准微球具备高稳定性、信号强度可追溯且批次间差异极小。
3. 操作步骤
将标准微球稀释至 1×10⁶ 个/mL；
加入 10 µL 悬液至计数片；
打开“Fluorescence Calibration”界面；
依次选择三个通道（Green → Red → Far Red）；
系统自动测定平均亮度值与信号分布；
若偏差超过±5%，自动调整 LED 电流与增益系数；
保存校准结果。
校准完成后，仪器会生成新的灵敏度曲线并存储于系统内。
六、信号线性与灵敏度验证
1. 线性测试
利用不同浓度的标准荧光微球，检测信号强度与浓度的线性关系。
步骤：
配制 5 组浓度梯度（1×10⁴ 至 1×10⁶ 个/mL）；
测定各浓度对应的平均荧光强度（RFU）；
绘制浓度-强度曲线，应呈现 R² ≥ 0.99。
2. 灵敏度检测
在低浓度（≤10⁴ 个/mL）样本中测量最小可检测信号。
系统应能分辨出强度信号为背景的 3 倍以上，确保检测灵敏度。
3. 多通道信号平衡
检测三通道间信号一致性，确保在相同强度标准下偏差不超过 5%。
七、计数算法校准
1. 目标
调整细胞识别算法的阈值与边界判定条件，使识别结果与显微镜人工计数一致。
2. 校准方法
使用直径均匀的标准微球样品；
仪器进行自动计数；
同时由操作员通过显微镜手动计数相同视野；
比较两者结果：
若误差 ≤3%，算法无需调整；
若误差 >3%，系统自动更新识别阈值（包括灰度界限与面积参数）。
3. 多通道算法校准
当进行双染或三染分析时，系统需校正通道间强度比值与分类边界。
例如 AO/PI 双染实验中，软件自动计算 Green/Red 信号阈值以区分活死细胞。
八、尺寸与浓度校准
1. 细胞尺寸验证
使用直径已知的标准微球（如 10 µm ±0.1 µm）进行校准：
仪器自动测定微球平均直径；
若偏差超过 ±2%，系统更新像素比例系数。
2. 浓度精度验证
将微球标准样品稀释至不同浓度，分别测量并计算线性回归：
若结果线性偏差 <3%，计数系统通过；
若偏差较大，则重新执行算法校准。
九、系统自检与自动维护
1. 自检内容
Countess 3 FL 内置自检程序，每次启动时自动执行以下项目：
光源强度检测；
相机像素响应校验；
滤片位置确认；
软件算法完整性校验；
存储空间与数据路径检查。
若检测到异常，系统会显示提示信息，并引导用户进入校准界面修复。
2. 自动维护机制
软件每隔 100 次检测自动执行光源亮度微调与暗噪声补偿，以防长期使用导致数据漂移。
十、定期校准建议
| 校准类型 | 周期 | 目的 |
|---|---|---|
| 光学聚焦与亮度校准 | 每周一次 | 保证图像清晰与光强均一 |
| 荧光通道校准 | 每月一次 | 校正光谱灵敏度与信号一致性 |
| 算法与浓度校准 | 每季度一次 | 保持计数精度与识别准确性 |
| 全系统自检 | 每次开机自动 | 检查设备功能状态 |
| 深度校准（由厂家） | 每年一次 | 全面性能恢复与部件检测 |
这些周期可根据实验频率与环境条件灵活调整。
十一、数据验证与溯源
1. 校准报告生成
完成校准后，软件自动生成报告，包括：
校准日期、操作者、样品类型；
每个通道的亮度曲线与偏差值；
系统自动修正参数（增益、曝光、阈值）；
校准合格标志。
报告以 PDF 格式保存，可导出或上传至云端，便于质量审计与数据溯源。
2. 数据追踪
系统保留最近 50 次校准记录，可在“Calibration History”中查看趋势图，以分析光源老化或通道漂移情况。
十二、误差来源与排查
| 误差类型 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 光源衰减 | 长期使用导致亮度下降 | 重新校准光源或更换 LED 模块 |
| 滤光片污染 | 灰尘或荧光残留 | 使用无尘布清洁滤片 |
| 聚焦偏差 | 样品厚度不均 | 重新执行自动聚焦校准 |
| 荧光信号不稳 | 环境光干扰或样品漂移 | 避免外界光线干扰，稳定载片 |
| 算法误差 | 细胞形态异常 | 调整识别阈值或切换检测模板 |
通过定期排查与维护，可有效保持仪器性能稳定。
十三、校准与实验结果关联
校准的精确度直接影响实验数据的可靠性：
活死细胞分析：荧光通道未校准可能导致活率误判；
浓度检测：尺寸比例系数偏差会引起浓度计算错误；
多色实验：通道漂移会造成信号重叠或强度失真；
时间序列研究：若未校准，长期数据趋势不具可比性。
因此，在任何定量研究、药物筛选或质控实验前，都应执行校准以确保数据可溯源。
十四、质量控制样本的使用
1. 校准样本储存条件
4°C 保存，避光存放；
每次使用前轻轻混匀，防止颗粒沉淀。
2. 校准样本寿命
推荐使用期为 6 个月，过期样品可能导致信号不稳定。
3. 替代标准
若无官方标准，可使用荧光强度稳定的染色细胞悬液作为替代，但必须建立自身参考曲线。
十五、校准后的性能评估
校准完成后，应进行性能验证：
检测标准微球样品三次，计算平均值与标准偏差；
若重复性（CV）≤5%，表示系统稳定；
若 CV 超过 5%，需重新执行光源与算法校准。
软件可自动生成性能评估报告，并保存为可追溯文件。
十六、安全与维护注意事项
在校准过程中，避免直视 LED 光源；
使用标准样品时戴手套操作，防止污染；
校准后应及时清洁载样槽和滤光片；
不得使用含酸或酒精的清洁剂，以防光学损伤；
若系统提示“Calibration Error”，应停止使用并检查日志文件。
