赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 FL Automated Cell Counter样品加载
质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司
一、概述
样品加载（Sample Loading）是赛默飞Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪操作流程中最关键的步骤之一。
它直接影响仪器的检测精度、图像质量与最终的细胞计数结果。
Countess 3 FL作为一款高分辨率自动化细胞计数与荧光分析系统，采用专用一次性或可重复使用的计数芯片（Countess Cell Counting Chamber）。该芯片的设计保证了液体流道的均匀性与厚度稳定性，从而实现对样品的高精度成像与定量分析。
在加载过程中，操作者需要保证细胞悬液浓度均匀、气泡排除彻底、样品体积合适，并确保芯片与仪器光学系统完美对位。
以下内容将对Countess 3 FL的样品加载流程、标准操作要求、优化方法及常见问题进行系统说明。
二、计数芯片结构与原理
1. 芯片构造
Countess系列专用芯片由上下两层透明塑料基板构成，中间夹有一层恒定厚度的流体间隙（通常为100 μm），形成用于细胞分布的检测腔体。
芯片主要由以下部分组成：
样品注入口（Sample Port）：用于加载细胞悬液；
毛细通道（Capillary Channel）：引导样品均匀流入检测腔；
检测区（Imaging Zone）：光学成像区域，对应仪器的成像视野；
排气口（Vent）：用于排除空气，防止气泡滞留。
芯片材料经过光学级加工，确保透明度高、厚度一致，从而避免折射误差。
2. 工作原理
当样品被吸入注入口后，毛细力驱动细胞悬液自动扩散至检测区。
在该腔体内，细胞会随机分布成单层状态，便于Countess 3 FL的成像系统进行识别与计数。
成像时，仪器光学系统通过明场或荧光光路对检测区域进行扫描，采集高分辨率图像，再由智能算法完成分析。
三、样品准备
样品准备是保证加载顺利和结果准确的前提。
1. 细胞样品要求
细胞状态：应处于健康、完整的悬浮状态；
细胞直径范围：4–60 μm；
细胞浓度：1×10⁴ – 1×10⁷ cells/mL（推荐1×10⁵ – 5×10⁶ cells/mL）。
对于贴壁细胞，必须经胰酶消化并充分重悬，以防止成团影响计数。
2. 样品混匀
在加载前，应使用移液器轻轻上下吹打数次，使细胞均匀分散。
若样品长时间放置，细胞会因重力沉降而导致浓度不均，应重新混匀后再取样。
3. 染色处理
根据检测目的选择不同染色方式：
明场检测（Bright Field）：台盼蓝（Trypan Blue）染色，用于活死细胞区分；
荧光检测（Fluorescence）：Calcein-AM/PI双染、GFP表达、RFP报告基因等。
混合比例建议为：
台盼蓝法：样品与染液 1:1 混合；
荧光染色法：按试剂说明书操作，保持终浓度适中。
四、样品加载步骤
整个加载流程应在洁净环境下操作，防止杂质或气泡干扰。
步骤1：准备工作
开启仪器并进入主界面；
取出干净的计数芯片；
准备好已混匀的细胞悬液；
使用10 μL移液器及无菌吸头。
步骤2：加载样品
吸取10 μL细胞样品；
将移液器垂直对准芯片注入口；
缓慢推注样品，使液体均匀进入通道；
观察液体是否平滑流入检测区；
检查排气孔是否完全充满，防止气泡残留。
步骤3：检查样品分布
检查样品是否充满检测区域，无空洞或未流到区域；
若发现气泡，应弃用该芯片重新加载。
步骤4：插入仪器检测槽
打开仪器样品槽门；
将芯片以正确方向插入（带样品端朝向标识方向）；
轻推至定位位置，听到卡扣声即表示插入到位；
关闭样品槽盖，开始检测。
步骤5：检测完成后处理
检测完毕后取出芯片；
若为一次性芯片，请立即弃置；
若使用可重复芯片，应以70%乙醇清洗并自然晾干。
五、样品加载技术要点
1. 样品体积控制
标准体积为10 μL；
体积过小：检测区未完全填充，导致细胞数偏低；
体积过大：可能溢出，污染仪器内部。
2. 加载角度
移液器应与芯片注入口呈45°角，既可避免气泡，又能确保流速均匀；
切勿垂直强行注入，易产生液体冲击导致气泡。
3. 流速控制
推注速度应平稳、连续，约1–2秒内完成；
过快会导致液体波动，影响细胞分布；
过慢则可能导致部分液体停留入口处，形成偏聚。
4. 样品均匀性
细胞必须在加载前保持均匀悬浮状态，否则不同区域细胞浓度不一致，会造成结果偏差。
5. 气泡处理
若样品中出现气泡：
可用移液器轻轻吹吸数次重新混匀；
避免重复使用含泡芯片；
确保液体在毛细通道中连续、无断层。
六、样品加载与检测匹配
Countess 3 FL的检测模式与样品类型直接相关，加载时应确保样品与模式匹配。
| 检测模式 | 推荐样品 | 染料 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 明场模式 | 悬浮细胞（HeLa, CHO, HEK293等） | 台盼蓝 | 活死细胞分析 |
| 荧光模式 | 转染或荧光标记细胞 | GFP, RFP, DAPI, PI | 转染效率分析或凋亡检测 |
| 双通道检测 | Calcein-AM/PI双染 | 双染组合 | 同时评估活性与死亡比例 |
样品的加载方式在各模式下相同，但荧光样品需避光操作，以防信号衰减。
七、常见问题与解决办法
| 问题现象 | 原因分析 | 解决措施 |
|---|---|---|
| 检测结果偏低 | 样品加载不足或气泡遮挡 | 检查芯片填充完整度，重新加载 |
| 检测结果偏高 | 背景杂质或碎片被识别 | 过滤样品或使用新鲜溶液 |
| 图像模糊 | 样品过厚或芯片放置不正 | 检查芯片方向并重新插入 |
| 细胞聚团 | 未充分混匀 | 轻轻吹匀后重新加载 |
| 无荧光信号 | 染料浓度过低或曝光不足 | 增加染料或调整曝光时间 |
| 图像过亮 | 曝光过度 | 启用自动曝光功能 |
八、优化加载技巧
1. 使用预湿法
对于粘稠样品，可先用少量培养基湿润芯片通道，再加载样品，减少气泡形成。
2. 预混染料
在加入染料时，应提前混匀样品与染液，防止染色浓度梯度影响细胞识别。
3. 控制温度
若样品温差较大（如冰上取样后立即检测），易产生冷凝气泡，建议将样品恢复至室温。
4. 校验加载效果
仪器在检测前会自动预览图像，用户可观察视野内细胞分布是否均匀，如发现密集或稀疏，应重新加载。
九、样品加载后的仪器响应机制
当芯片插入仪器后，Countess 3 FL自动执行以下任务：
样品识别：检测芯片是否插入正确；
自动聚焦：调整光学焦点至细胞平面；
亮度调节：根据样品类型设定光源强度；
采集成像：明场与荧光图像同步获取；
数据分析：算法自动统计并显示结果。
这一系列自动化操作确保加载样品后，用户无需再手动调整参数即可获得准确结果。
十、样品加载对检测结果的影响分析
1. 加载均匀性与计数误差
样品分布是否均匀决定了算法识别的代表性。若细胞集中分布在局部区域，会造成显著误差。
2. 液层厚度与成像质量
腔体内液层厚度不均将导致部分区域失焦，影响图像清晰度。
3. 污染或残留物干扰
重复使用芯片若清洁不彻底，残留蛋白或染料可造成背景噪声。
4. 气泡与反射光干扰
气泡会产生光学反射，使系统误判空洞为细胞阴影。
因此，标准化的加载流程是保证检测准确性与重复性的关键。
十一、清洁与维护
1. 一次性芯片
使用后直接弃置；
禁止重复使用以避免交叉污染。
2. 可重复芯片
每次使用后用70%乙醇清洗；
以去离子水冲洗两次；
自然晾干或使用无尘纸巾轻拭；
避免金属器具刮擦表面。
3. 仪器样品槽
每天检测结束后用干净棉签蘸无水乙醇清洁；
避免液体渗入光学系统。
十二、样品加载在不同检测应用中的意义
细胞计数与活性检测
加载均匀保证活死细胞比例准确；
稀释恰当避免计数饱和。
荧光检测与转染效率分析
样品厚度一致可提高荧光信号一致性；
均匀加载保证阳性细胞比例可重复性。
生物制药质控检测
标准化加载程序确保批次间数据可比性。
干细胞与原代细胞研究
减少机械应力，保护脆弱细胞形态完整。
十三、性能验证与数据稳定性
经多实验验证，在正确加载条件下，Countess 3 FL的结果具有高一致性：
| 测试条件 | 计数误差 | 重复性（CV） | 检测时间 |
|---|---|---|---|
| 标准加载 | ±5% | ≤3% | 8–12 秒 |
| 加载不均 | ±15% | ≥10% | 误差显著 |
| 含气泡样品 | ±20% | ≥12% | 图像识别错误 |
| 稀释样品 | ±5% | ≤4% | 推荐范围 |
数据表明，标准化样品加载操作是维持精确度的核心因素。
十四、安全与规范要求
操作时应佩戴防护手套与实验服；
样品加载区域保持干燥、清洁；
使用完芯片后立即密封废弃容器；
若处理感染性样品，遵守生物安全规范（BSL-2以上）；
禁止使用有机溶剂清洁仪器样品槽。
