质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

在现代分子与细胞生物学研究中，**转染效率分析（Transfection Efficiency Analysis）**是评估基因导入效果与实验成功率的重要指标。无论是质粒DNA、siRNA、mRNA或病毒载体转染，研究人员都需要精准地计算有多少比例的细胞成功表达目标基因。

赛默飞Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪凭借其高分辨率成像系统与三通道荧光检测技术（Blue, Green, Red），能够快速、准确地进行转染效率的自动化分析。仪器通过识别带有荧光信号的阳性细胞，并将其与总细胞数进行比对，自动计算转染效率百分比，同时提供图像、统计图表及完整数据报告。

该系统的分析结果具有高灵敏度、高重复性和高通量特征，为科研人员在基因功能研究、药物筛选、细胞系构建及病毒载体开发中提供了强大的定量工具。

二、原理简介

Countess 3 FL的转染效率分析基于荧光标记检测原理，主要通过以下两类策略实现：

1. 荧光报告基因检测法

在转染载体中引入荧光报告基因（如GFP、RFP、mCherry、BFP等）。转染成功的细胞会表达相应荧光蛋白，在特定波长光源激发下发出可检测的荧光信号。仪器通过检测荧光阳性细胞比例计算转染效率。

2. 荧光共转染或标记分子检测法

对于非荧光基因转染，可在体系中共转染荧光标记物，或使用特异性荧光探针（如FITC、Cy3、Alexa Fluor等）标记目标蛋白，从而间接反映转染效果。

三、光学与成像系统

Countess 3 FL内置三通道荧光检测系统，可同时检测多种常见报告基因或标记染料。

成像系统由高灵敏度CMOS传感器与精密光学组件组成，具备以下特点：

• 成像分辨率：1.5 μm/像素；

• 信噪比 ≥35 dB；

• 自动曝光与自动聚焦；

• 三通道独立采集与叠加显示；

• 光源寿命 >25,000小时。

该光学系统确保即便荧光信号较弱或细胞密度较高，仍能实现清晰、无干扰的荧光捕获。

四、检测样品准备

1. 细胞培养

• 使用生长状态良好、对数生长期的细胞进行转染；

• 细胞活性应≥90%，以保证转染成功率；

• 推荐浓度：1×10⁵–5×10⁵ cells/mL。

2. 转染操作

• 根据实验设计选择合适的转染试剂（脂质体、电转或病毒载体）；

• 在转染体系中加入含荧光报告基因的质粒（如pEGFP-N1、pDsRed-Express等）；

• 转染后孵育24–48小时，待荧光蛋白表达充分。

3. 样品染色（可选）

若需要同时评估细胞活性，可加入台盼蓝或Calcein-AM/PI双染试剂。
这可同时获得转染率与活细胞比例的双重信息。

五、检测流程

1. 样品加载

• 吸取10 μL细胞悬液；

• 加入Countess专用计数芯片；

• 确保液体均匀铺满腔体，避免气泡；

• 插入仪器检测槽。

2. 仪器设置

1. 选择“Fluorescence Mode”；

2. 设置检测通道（如Green或Red）；

3. 选择样品类型（单通道或多通道检测）；

4. 设定曝光时间（自动模式推荐）；

5. 点击“Start Count”启动分析。

整个检测与分析过程约需8–12秒即可完成。

六、结果分析原理

Countess 3 FL的算法系统在荧光成像基础上执行多步骤分析：

1. 图像预处理

• 自动进行背景扣除与光照均一化；

• 平滑噪声、增强对比度；

• 修正光谱串扰（Spectral Crosstalk）。

2. 边界识别与细胞分割

• 使用基于形态学的AI边缘检测算法（Adaptive Edge Detection）；

• 对重叠细胞进行分水岭（Watershed）分割；

• 排除碎片与非细胞结构。

3. 信号分类

系统根据荧光信号强度阈值区分阳性与阴性细胞。

• 阳性细胞（Fluorescent Positive）：荧光强度高于设定阈值；

• 阴性细胞（Fluorescent Negative）：信号低于阈值或无荧光。

4. 统计计算

计算公式如下：

Transfection Efficiency (%)=Number of Fluorescent Positive CellsTotal Number of Cells×100\text{Transfection Efficiency (\%)} = \frac{\text{Number of Fluorescent Positive Cells}}{\text{Total Number of Cells}} \times 100Transfection Efficiency (%)=Total Number of CellsNumber of Fluorescent Positive Cells×100

仪器同时输出以下参数：

• 阳性细胞总数；

• 阴性细胞总数；

• 平均荧光强度；

• 荧光信号分布直方图。

七、结果显示与输出

检测完成后，系统会生成包括以下内容的分析报告：

1. 数值结果

• Total Cells（总细胞数）

• Fluorescent Positive Cells（荧光阳性细胞）

• Transfection Efficiency（转染效率%）

• Mean Fluorescence Intensity（平均荧光强度）

2. 图像显示

• 明场图像：显示所有细胞的形态结构；

• 荧光图像：显示表达荧光蛋白的阳性细胞；

• Overlay叠加图像：绿色或红色信号覆盖在细胞轮廓上，可直观展示阳性比例。

3. 图表输出

• 转染效率柱状图；

• 荧光强度直方图；

• 细胞数量与信号强度散点图。

4. 文件导出

数据可通过USB或LAN导出为：

• PDF报告（含图像与图表）；

• CSV数据表（用于统计与分析软件）；

• TIFF/JPEG图像（用于科研发表）。

八、不同通道与标记物应用

通过多通道联合检测，Countess 3 FL可在一次检测中同时完成细胞总数统计、阳性识别与活性分析，大大提高效率。

九、性能验证与线性度测试

1. 转染率线性相关性

在不同转染剂量或质粒浓度下，仪器检测的荧光阳性比例与理论值线性相关：

R2≥0.99R^2 ≥ 0.99R2≥0.99

说明Countess 3 FL具备高度准确的定量能力。

2. 重复性验证

同一样品连续检测10次，转染率变异系数（CV）≤3%，显示出极佳的重复性。

3. 灵敏度

可识别荧光信号强度差异≥10倍的样品，弱信号细胞识别准确率≥95%。

4. 聚团识别性能

通过AI分割算法，重叠细胞的识别成功率达97%以上，保证统计结果的真实性。

十、常见实验类型应用

1. 质粒DNA转染效率检测

• 常用于评估转染试剂性能或转染条件优化；

• GFP、RFP为最常用报告基因；

• 可通过不同载体或质粒剂量比较转染效果。

2. siRNA或mRNA转染验证

• 结合荧光标记siRNA或荧光探针进行检测；

• 评估RNA导入成功率与细胞存活状态。

3. 病毒载体转导效率分析

• 适用于慢病毒、腺病毒或AAV载体；

• 检测转导后目标基因的表达阳性率；

• 可在不破坏样品的情况下快速获取定量结果。

4. 多通道共转染分析

• 检测双荧光表达系统，如GFP与mCherry共转染；

• 通过双通道叠加图像分析共表达比例与单阳性比例。

十一、结果误差与校正

系统自动提供参数优化建议，确保检测条件达到最优状态。

十二、数据应用与报告分析

Countess 3 FL生成的转染效率数据可直接用于以下分析：

1. 转染条件优化：比较不同试剂、DNA比例或孵育时间；

2. 载体构建验证：确定新质粒或病毒载体的表达性能；

3. 药物效应研究：评估药物对基因表达的调控作用；

4. 生产质控：监控细胞系或批次转染稳定性。

报告包含图像与量化数据，可直接用于科研发表或实验记录。

十三、系统优势

1. 高精度自动识别

• 采用AI算法，自动区分阳性与阴性细胞；

• 转染率准确度高达±3%。

2. 多通道同步检测

• 支持Blue/Green/Red三通道荧光成像；

• 适合复杂的共转染与多标记实验。

3. 快速分析

• 检测时间仅需8–12秒，远快于人工统计。

4. 数据直观

• 图像叠加与柱状图呈现结果，清晰可视。

5. 可追溯性强

• 自动生成样品编号、时间戳与操作人记录。

6. 兼容性高

• 支持多种细胞类型，包括悬浮系、贴壁系及原代细胞。

十四、注意事项

1. 转染后至少培养24小时再检测，以确保荧光蛋白充分表达；

2. 样品应避光处理，防止荧光信号衰减；

3. 若信号过强，可适当缩短曝光时间防止过曝；

4. 荧光通道间切换时应避免交叉污染；

5. 每周进行光源与滤光片校准，保持检测稳定性。

十五、性能验证实例

在GFP质粒转染HEK293细胞的实验中，Countess 3 FL的转染率测定结果与流式细胞术（Flow Cytometry）相比误差仅±2.5%，相关系数R²≥0.99。

在RFP-mCherry双转染模型中，仪器可准确区分：

• 双阳性细胞比例；

• 单阳性（仅GFP或RFP）细胞比例；

• 阴性细胞比例。

同时，系统输出的平均荧光强度曲线与显微镜图像定量结果完全一致，验证了其准确性与可重复性。