质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

赛默飞Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪是一款集明场与荧光成像、自动识别与定量分析于一体的高性能细胞检测系统。其样品浓度范围（Sample Concentration Range）是决定计数准确性、重复性与数据稳定性的重要参数之一。

该仪器的检测范围覆盖从低密度稀释细胞悬液到高浓度密集细胞群体，在1×10⁴ 至 1×10⁷ cells/mL的宽范围内均可实现高精度自动计数。通过智能图像识别算法、动态聚焦与光学调整技术，Countess 3 FL能在不同浓度下维持稳定的检测性能。

合理控制样品浓度不仅有助于获得准确计数结果，还能避免因过度稀释或高密度聚团而造成的误差。本文将系统介绍该仪器的样品浓度范围、检测机制、优化策略及其在不同实验类型中的应用。

二、样品浓度范围定义

1. 有效浓度范围

根据官方技术规范与实验验证，Countess 3 FL的有效检测范围为：

1×104 至 1×107 cells/mL1×10^4 \text{ 至 } 1×10^7 \text{ cells/mL}1×104 至 1×107 cells/mL

其中：

• 推荐浓度范围： 1×10⁵ – 5×10⁶ cells/mL；

• 最优计数精度范围： 2×10⁵ – 2×10⁶ cells/mL。

在此范围内，系统能自动识别并计数单个细胞，维持误差小于±5%，重复性（CV）不超过3%。

2. 上限说明

当样品浓度超过1×10⁷ cells/mL时，细胞在计数芯片中的分布密度过高，容易形成聚团或重叠。此时：

• 系统会提示“High Density – Dilution Recommended”；

• 可能出现细胞漏计或多计；

• 光学信号易饱和，导致背景识别误差。

3. 下限说明

当样品浓度低于1×10⁴ cells/mL时，单位视野中细胞数过少，随机误差明显增大。系统虽能识别个体，但统计学代表性降低。

因此，为确保统计精度与可靠性，应尽量使样品浓度处于推荐范围。

三、浓度测定原理

Countess 3 FL的细胞浓度计算基于光学图像识别与体积换算原理：

1. 采集图像后，系统识别出每个独立细胞对象；

2. 统计在检测视野（已知体积）内的细胞数量；

3. 将该数值换算为每毫升样品的细胞浓度。

其基本计算公式为：

Concentration (cells/mL)=Counted Cells in FOVFOV Volume (mL)×Dilution Factor\text{Concentration (cells/mL)} = \frac{\text{Counted Cells in FOV}}{\text{FOV Volume (mL)}} \times \text{Dilution Factor}Concentration (cells/mL)=FOV Volume (mL)Counted Cells in FOV×Dilution Factor

其中，FOV Volume（视野体积）由计数芯片腔体高度与视野面积决定，通常为2.5×10⁻⁶ mL。系统会自动根据样品浓度调整采样次数与统计算法，以保持稳定精度。

四、浓度范围对检测精度的影响

1. 高浓度样品

当样品浓度过高时，主要影响包括：

• 聚团现象：细胞相互贴合，导致单个识别对象被误判为一个细胞；

• 图像遮挡：重叠细胞造成边界识别困难；

• 光线散射增强：信号饱和影响对比度；

• 统计偏低：总细胞数低估。

2. 低浓度样品

样品浓度过低时可能出现：

• 视野中细胞数量过少，导致统计波动加大；

• 活性比例计算误差增加；

• 重复检测的变异系数上升。

3. 优化建议

• 高浓度样品建议稀释至2×10⁶ cells/mL以下；

• 稀释时使用等渗缓冲液（PBS或培养基）；

• 稀释倍数自动输入至系统以校正最终结果；

• 对低浓度样品可重复采样2–3次取平均值。

五、不同模式下的浓度适配

Countess 3 FL支持**明场（Bright Field）与荧光（Fluorescence）**两种模式，不同检测方式对样品浓度的适配要求略有差异。

1. 明场模式

适用于台盼蓝染色法检测：

• 推荐浓度：1×10⁵–5×10⁶ cells/mL；

• 可视化清晰度高，适合活死细胞区分；

• 过高浓度会造成染色不均与背景干扰。

2. 荧光模式

适用于GFP、PI、DAPI等荧光染色样品：

• 推荐浓度：5×10⁴–2×10⁶ cells/mL；

• 过高浓度会导致荧光信号重叠；

• 过低浓度可能信号不足。

3. 多通道复合分析

在双荧光或三荧光检测时，应适当降低样品浓度，以保证每个细胞的信号独立成像。

六、浓度校准与自动调整功能

Countess 3 FL内置自动浓度校准系统，可根据检测结果动态优化参数。

1. 自动聚焦校正：根据细胞密度调整焦点深度；

2. 曝光时间调节：高浓度样品缩短曝光时间，防止过曝；

3. 区域采样算法：对高密度样品自动分块计数；

4. 稀释提示功能：检测到饱和图像后自动提示稀释比例。

该系统可保证无论样品浓度处于低、中、高区间，计数精度均保持稳定。

七、样品制备与浓度控制方法

1. 样品混匀

在吸取前轻轻吹打悬液，使细胞分布均匀，避免因沉降造成局部浓度差。

2. 稀释步骤

若样品浓度超过5×10⁶ cells/mL，可按以下步骤操作：

• 取100 μL样品加入900 μL等渗溶液；

• 混匀后检测，系统自动记录稀释倍数（×10）。

3. 染色比例

• 明场模式（台盼蓝法）：样品与染液1:1混合；

• 荧光模式（Calcein-AM/PI）：按推荐浓度染色后检测。

4. 样品体积

每次加载样品10 μL为最佳，既能保证统计充分，又避免过度浪费。

八、浓度线性度与性能验证

Countess 3 FL在全浓度范围内的线性度表现优异，经过验证可达：

线性关系验证表明，在推荐浓度范围内，仪器计数与理论值呈强相关性，且重复性高。

九、不同细胞类型的浓度特征

不同细胞系的大小与形态差异会影响最优浓度设定。

对于高直径或不规则细胞，可适当降低浓度以减少聚团干扰。

十、浓度超限情况下的误差修正

1. 过高浓度时

• 图像聚团导致计数偏低；

• 系统自动提示稀释倍数；

• 建议按比例稀释后重新检测。

2. 过低浓度时

• 单视野细胞数量不足；

• 统计不具代表性；

• 建议重复检测3次取平均值。

3. 自动修正算法

Countess 3 FL采用“多区域统计校正法”，当样品浓度偏离标准范围时，系统会：

• 采集多视野图像；

• 计算平均密度并修正总值；

• 提供“Corrected Concentration”结果以供参考。

十一、浓度控制在实验流程中的重要性

1. 细胞培养阶段

• 准确浓度计数可控制接种密度；

• 过高密度可能导致营养耗尽，过低则生长缓慢。

2. 转染实验

• 适当的浓度保证转染效率与细胞健康。

3. 药物筛选实验

• 统一浓度可确保各处理组条件一致。

4. 流式细胞术前准备

• 稀释至合适浓度可防止流式管堵塞，确保检测线性。

十二、浓度结果输出与报告

检测完成后，仪器自动在结果界面显示浓度数据，并可导出：

• 单样品PDF报告；

• 批量CSV数据文件；

• 含浓度与活性统计图表。

报告中包含以下关键参数：

• Total Cell Concentration (cells/mL)

• Live Cell Concentration (cells/mL)

• Dead Cell Concentration (cells/mL)

• Viability (%)

• Dilution Factor (×)

这些结果可直接用于科研记录、生产质量控制与实验数据分析。

十三、浓度检测重复性与稳定性验证

实验表明，无论在低、中或高浓度下，仪器均能保持优良的重复性，计数偏差极小。

十四、常见问题与解决方案

十五、性能优势总结

1. 宽检测范围

• 从1×10⁴到1×10⁷ cells/mL均可准确测定。

2. 自动稀释提示

• 智能识别浓度异常并给出优化建议。

3. 线性度高

• 检测结果与理论值呈高度相关。

4. 重复性优越

• CV低于3%，确保数据一致性。

5. 多模式兼容

• 明场与荧光模式下均具浓度适配算法。

6. 实时显示与导出

• 检测结果即时生成，可快速导出报告。