质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、样品制备的重要性与总体原则

样品制备是 Countess 3 FL 自动细胞计数仪 获取精准结果的核心环节。
该仪器依赖高分辨率光学成像与智能算法识别细胞形态、荧光信号及活性状态，因此样品的均匀性、纯净度与浓度控制直接决定计数精度与可重复性。

在细胞计数实验中，样品制备应遵循以下原则：

1. 单细胞悬液原则：确保样本中细胞充分分散，避免团聚。

2. 浓度适中原则：控制细胞浓度在仪器检测范围内。

3. 染色一致原则：染料比例、孵育时间与光照条件保持恒定。

4. 操作无污染原则：保证样本不含碎屑、气泡或杂质。

5. 时间敏感原则：从染色到检测时间应尽量缩短，避免信号衰减或细胞状态变化。

Countess 3 FL 可进行明场（Brightfield）与多通道荧光（Fluorescence）检测，因此样品制备方案需根据实验模式进行区分与优化。

二、样品类型与适用范围

该仪器支持多种细胞类型的检测，包括：

• 悬浮培养细胞（如 Jurkat、K562 等）

• 贴壁细胞经胰酶消化后的单细胞悬液（如 HeLa、293T 等）

• 原代细胞、干细胞及免疫细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞）

• 荧光标记细胞（GFP/RFP、FITC/PE 染色）

• 经染料标记的死细胞或凋亡细胞

不同类型细胞在样品制备过程中存在细微差别，但目标一致：获得均匀、清洁、适度浓度的单细胞悬液。

三、细胞收集与预处理

1. 悬浮细胞样本

• 轻轻混匀培养瓶或离心管，使细胞分布均匀。

• 取 1 mL 细胞悬液，以 300 × g 离心 5 分钟。

• 去除上清，保留细胞沉淀。

• 用 PBS 或无血清培养基重悬，轻轻吹打混匀，形成均匀悬液。

2. 贴壁细胞样本

• 吸去培养液，用 PBS 清洗细胞单层。

• 加入适量 0.25% 胰酶消化 1–3 分钟，待细胞脱落。

• 加入培养基终止消化，轻轻吹打分散。

• 以 300 × g 离心 5 分钟后重悬于 PBS。

• 检查显微镜下细胞是否分散均匀，如仍聚集，可轻轻反复吹打。

3. 原代或组织细胞

• 使用组织消化液（如胶原酶、胰酶）消化组织样本。

• 通过 40 µm 滤网过滤，去除组织碎片。

• 离心收集细胞，重悬于 PBS 或无血清培养基。

四、浓度与体积控制

Countess 3 FL 推荐的检测浓度范围为 1×10⁵–4×10⁶ cells/mL。

1. 浓度过高的影响

• 细胞重叠，算法无法区分个体，导致计数偏低；

• 荧光信号聚集，亮度过饱和。

2. 浓度过低的影响

• 有效样本数量不足，统计误差增大；

• 系统自动计算浓度误差高。

3. 稀释方法

若浓度过高，可按以下公式稀释：

C1V1=C2V2C_1V_1 = C_2V_2C1V1=C2V2

其中 C1C_1C1 为原始浓度，C2C_2C2 为目标浓度。
使用无血清 PBS 或培养基进行稀释，保持细胞状态稳定。

五、染色方法与试剂选择

Countess 3 FL 支持多种染色模式，包括台盼蓝法（Trypan Blue）及荧光双染法（AO/PI、FITC/PI、DAPI 等）。

（一）台盼蓝染色（Brightfield Mode）

适用于明场检测，常用于计算活细胞比例。

• 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液混合（1:1）。

• 轻轻混匀，避免气泡。

• 静置 1–2 分钟，立即上样。

• 活细胞不被染色，死细胞呈蓝色。

注意事项：

• 染色时间超过 5 分钟会导致部分活细胞假阳性。

• 每次实验需使用新鲜配制的染液。

（二）AO/PI 双染法（Fluorescence Dual Channel Mode）

用于荧光通道检测活死细胞。

• AO（Acridine Orange）：穿透细胞膜并结合核酸，发绿光。

• PI（Propidium Iodide）：仅进入膜受损细胞，发红光。

步骤：

1. 取 100 µL 细胞悬液加入 2 µL AO/PI 混合染液。

2. 避光孵育 3 分钟。

3. 轻轻混匀后立即检测。

结果判定：

• 绿色细胞 → 活细胞；

• 红色细胞 → 死细胞；

• 双阳性 → 凋亡或受损细胞。

（三）GFP/RFP 荧光样本

适用于检测转染或感染效率。

• 若细胞自身表达荧光蛋白，无需额外染色。

• 建议用 PBS 洗涤两次，去除培养基荧光背景。

（四）DAPI/Hoechst 染核染色

用于检测细胞核完整性、细胞数与活性。

• 加入 1 µg/mL DAPI，避光染色 5 分钟。

• 适合检测凋亡或核分裂异常样本。

六、上样步骤与玻片准备

1. 使用一次性计数玻片

• 取 10 µL 染色样品，加入计数腔入口。

• 液体应自然充满腔体，无气泡。

• 确保液层均匀、无残留颗粒。

2. 使用可重复玻片

• 使用前清洗玻片：用去离子水冲洗后以 70% 乙醇擦拭干净。

• 每次上样前确保玻片干燥无指纹。

• 实验结束后立即用去离子水冲洗，防止染料残留。

3. 上样操作注意事项

• 样品应缓慢加入计数腔，避免液体冲击产生气泡。

• 若样品浓度高，可提前稀释。

• 加样后静置 10–20 秒，确保细胞分布均匀。

七、样品质量控制与误差预防

1. 防止气泡

• 加样针头应贴近玻片边缘缓慢注入；

• 出现气泡会遮挡视野或干扰计数区域，应重新上样。

2. 防止细胞沉降

• 在制备与染色后 2 分钟内完成检测；

• 若等待时间较长，应轻轻混匀样本。

3. 去除碎屑与聚集物

• 通过 40 µm 滤网过滤细胞悬液；

• 可加入 1% BSA 以减少细胞间黏附。

4. 稀释倍数准确性

• 若需稀释，应记录精确体积以保证浓度计算正确。

5. 染料均匀性

• 在加入染料后立即轻轻混匀；

• 染料浓度不均将导致信号差异。

八、不同实验目的下的样品优化方案

九、样品制备的时间与环境控制

1. 温度控制

• 室温（20–25°C）下操作，避免过热或过冷导致细胞膜通透性变化。

2. 光照控制

• 荧光染色样本全程避光，防止光漂白。

3. 时间控制

• 从染色到检测不超过 10 分钟。

• 长时间放置会导致细胞凋亡或染料扩散，影响数据。

4. 离心条件标准化

• 建议离心速度 300 × g，时间 3–5 分钟，防止细胞破裂。

十、特定样品类型的优化策略

1. 高粘度培养基样本

• 使用 PBS 稀释 1:1，降低粘度。

• 轻轻吹打分散细胞，防止黏附。

2. 红细胞或血液样本

• 需进行红细胞裂解处理，保留白细胞或目标细胞。

• 洗涤两次以去除血红蛋白干扰。

3. 高荧光背景样本

• 洗涤三次以减少游离染料。

• 调整曝光参数，避免过饱和。

4. 极小或极大细胞

• 可调整算法的“Cell Size Range”参数：

• 小细胞（如淋巴细胞）设定 5–10 µm；

• 大细胞（如巨噬细胞）设定 15–30 µm。

十一、数据一致性与标准化

为了确保跨实验数据的可比性，应建立标准化样品制备流程：

• 每个实验批次使用相同染料批号与浓度；

• 统一离心条件与染色时间；

• 对每种细胞类型建立固定模板；

• 每周使用标准样本（如 Count Beads）验证重复性。

建议使用实验室 SOP（Standard Operating Procedure）文件记录每次制备细节，包括稀释倍数、染色比例、孵育时间等，以保证长期可追溯性。

十二、常见问题与解决方案

十三、质量控制与样品验证

1. 显微镜检查
   在计数前可使用普通显微镜检查细胞是否均匀、无碎屑。

2. 标准粒子对照
   使用荧光微球作为标准，验证荧光通道灵敏度。

3. 重复测量
   同一样本重复测两次，结果差异应低于 5%。

4. 统计一致性
   若结果波动较大，应检查样本浓度与染色操作。

十四、安全注意事项

• 使用 AO、PI 等染料时佩戴手套与防护镜。

• 所有含染料或细胞废液按生物废弃物处理。

• 避免染料接触皮肤与光源直接照射眼睛。

十五、样品制备自动化与数字化趋势

Countess 3 FL 已支持部分半自动化制备方案：

• 可与移液工作站配合，实现固定体积取样与稀释；

• 软件可保存每次样品制备参数，用于统计分析与追踪；

• 与 LIMS 系统对接后，样品编号、制备时间及操作者信息自动录入报告中。

这一体系使实验数据更标准化，也方便实验室间共享与质量审计。

十六、样品制备的科学意义

高质量的样品制备不仅是获得准确数据的前提，更体现了细胞实验的科学规范性。
Countess 3 FL 的强大算法与光学性能必须依托均匀、纯净的样品才能充分发挥。
规范的制备步骤可显著降低实验偏差，提升实验室间的结果可比性，为后续细胞培养、药物筛选、免疫分析及基因编辑实验提供可靠数据基础。