赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 FL Automated Cell Counter荧光模式
质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司
一、荧光模式概述
Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪是 Countess 系列中功能最强的型号之一。相比标准的 Countess 3，其最大特色在于引入三通道荧光检测系统，实现了对细胞活性、转染效率、标志物表达及荧光信号分布的定量化检测。
荧光模式通过高灵敏度的成像传感器和精密光学滤光片组，将细胞发出的荧光信号与明场图像同步捕获。系统可在 30 秒内完成多通道成像与自动识别，输出活细胞、死细胞、荧光阳性群体比例、信号强度分布等参数。
荧光模式的核心优势在于：
多参数检测：可同时识别活死状态、报告基因表达或荧光标记蛋白信号。
高灵敏度与低背景噪声：采用高通量滤光与信号放大算法，可检测弱荧光细胞。
无须额外显微镜设备：自动化光路与算法简化操作，减少人为误差。
与明场模式完美融合：实现形态与荧光信号的同步分析。
二、荧光检测的光学系统原理
1. 光源与激发机制
Countess 3 FL 内置三组高强度 LED 光源，分别对应绿光（FITC/AO 通道）、红光（PI/RFP 通道）与远红光（Cy5/DRAQ5 通道）。
绿光通道：中心波长约 470–495 nm，用于激发 GFP、AO 等染料。
红光通道：中心波长约 530–560 nm，用于激发 PI、RFP 等染料。
远红通道：波长 630–660 nm，适合检测深色荧光染料如 Cy5、DRAQ5。
光源发出的激发光通过特定激发滤光片（Excitation Filter），照射样本；样本发出的荧光信号再经发射滤光片（Emission Filter）选择性通过，进入高灵敏度 CMOS 检测器。
2. 光路结构
系统采用共轴反射光路，通过光学分光镜将激发与发射光分离，确保荧光信号纯净无串扰。
反射镜组具有高反射率涂层，使信号损失极小。不同通道通过电动滤片轮切换，完成多波段荧光采集。
3. 成像与同步捕获
明场与荧光图像由同一成像镜头捕获，实现几何位置的完全重合。
系统通过硬件级同步触发机制，在毫秒级时间差内采集三通道图像，防止样本漂移或曝光差异。
三、荧光模式的操作流程
1. 样本准备
制备悬浮或消化后的单细胞悬液，浓度建议在 1×10⁵–4×10⁶ cells/mL。
根据实验目的选择染料，如 AO/PI、DAPI、Hoechst、FITC、RFP 等。
染色后避光孵育 2–5 分钟，轻轻混匀。
若使用双染体系（AO/PI 或 GFP/RFP），确保荧光光谱互不重叠。
2. 计数片准备
使用一次性 Countess 计数玻片，上样量为 10 µL。
保证液层均匀无气泡，插入仪器载片槽。
3. 模式选择
打开仪器，点击 “Count” 进入主界面。
选择 “Fluorescence Mode” 并勾选所需通道，如 “Green + Red” 或 “Green + Far Red”。
可启用自动曝光或手动调整参数。
4. 自动聚焦与采集
仪器启动自动聚焦功能，选择焦平面后依次采集三通道图像。
系统自动融合明场与荧光图像，叠加呈现。
用户可在屏幕实时预览每个通道的信号强度与对比度。
5. 数据识别与统计
算法自动检测单个细胞区域，测量每个细胞的荧光强度。
根据预设阈值分类为阳性、阴性或双阳性群体。
输出统计结果与图像叠加层。
四、荧光信号检测与分析原理
1. 图像分割与信号识别
系统采用多级阈值分割算法，将每个细胞在明场图像中定位，再在对应荧光通道中测量平均亮度与最大信号值。
通过比较背景与细胞信号差异，自动剔除碎片和噪声。
2. 阈值设定
荧光强度阈值由算法自动生成，也可手动设定。
自动阈值模式：系统根据图像灰度直方图计算分界点，适合常规样本。
手动阈值模式：研究者可自定义阳性判定标准，用于特殊荧光体系。
3. 背景扣除
Countess 3 FL 内置实时背景扣除功能：通过局部区域平均值减去背景信号，减少光漂白或非特异荧光干扰。
4. 聚集体识别
荧光信号中若出现高亮大斑点，算法会自动判定为聚集体并排除。
系统在结果中输出“Aggregate %”以表征样本分散性。
5. 信号量化
每个细胞的荧光信号被记录为相对荧光单位（RFU），可输出为数值表格。
系统可自动计算平均荧光强度（Mean Intensity）和标准差，用于群体比较。
五、常见荧光检测模式与应用场景
1. AO/PI 双染活死检测
原理：AO 可穿透细胞膜并结合核酸发出绿色荧光；PI 仅能进入膜受损的死细胞并发出红色荧光。
结果：
绿色：活细胞；
红色：死细胞；
双阳性：晚期凋亡细胞。
应用：快速评估培养状态、药物处理后细胞存活率。
2. GFP/RFP 双通道转染效率检测
检测细胞转染后 GFP 与 RFP 报告基因的表达比例。
仪器能在绿红通道同时统计阳性率，输出阳性细胞百分比与荧光强度分布。
应用：基因编辑、报告系统验证、病毒感染效率评估。
3. DAPI/Hoechst 染核分析
在远红或蓝光通道下检测细胞核染色强度。
可用于细胞计数、核质比分析、细胞周期阶段识别的预实验。
4. 免疫荧光表面标志检测
检测特定蛋白如 CD4、CD8、EpCAM 等的荧光标记表达。
利用多通道组合，可同时区分多种表型群体。
5. 荧光强度分布研究
通过统计直方图分析群体内荧光信号差异，反映细胞异质性或表达量差别。
六、荧光模式数据输出与图形化结果
Countess 3 FL 在荧光模式下可生成多种数据与图形输出：
荧光叠加图像（Overlay Image）
明场 + 多通道荧光图层同时显示，细胞轮廓清晰可见。通道独立图像
用户可单独查看各通道图像，用于信号分析或论文插图。荧光直方图（Fluorescence Intensity Histogram）
反映不同强度区间细胞数量分布。活死比例条形图
自动生成活细胞与死细胞百分比可视化结果。统计数据表格
包含：总细胞数、各通道阳性细胞数、活率、平均强度、聚集体比例等参数。导出文件格式
CSV：含全部数值与荧光强度数据；
PDF：含图像、图表与汇总报告；
PNG/TIFF：高分辨率图像用于发表或记录。
七、荧光模式参数优化建议
为了获得最佳成像效果与数据准确性，建议按以下原则操作：
光强与曝光控制
在信号较弱时适当延长曝光时间；
若信号过饱和，则降低光强或曝光值。
荧光染料匹配
确保染料的激发/发射峰值与通道波长相匹配；
避免两种荧光谱线重叠导致信号串扰。
样本制备一致性
细胞浓度与染料比例保持稳定，防止批间误差。
对所有样本采用相同孵育时间与温度。
模板保存与复用
对同一类型实验（如 AO/PI 检测）建立标准模板，减少重复设定。
信号稳定性
染色后应立即上样，避免光漂白。
关闭环境强光，防止背景干扰。
聚焦精度
自动聚焦完成后可微调焦点，以最大化信号边缘清晰度。
八、荧光数据的定量与应用分析
Countess 3 FL 的荧光模式不仅用于定性观察，更能进行定量计算与统计分析。
1. 荧光阳性比例
系统统计阳性细胞占总细胞的百分比，用于描述转染效率或标志物表达水平。
2. 平均荧光强度（Mean Intensity）
反映群体整体的信号强度，常用于药物处理或转染表达量比较。
3. 信号分布宽度（Standard Deviation）
代表细胞间的荧光异质性，帮助判断群体是否均一。
4. 多通道相关性分析
在双通道模式下，系统可输出双参数散点图（Green vs Red），展示不同细胞群体的分布关系。
5. 聚集体修正
算法自动剔除聚集体信号，确保结果反映真实单细胞特征。
九、常见问题与解决方案
| 问题 | 原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 荧光信号过弱 | 染料浓度低或曝光不足 | 增加染料浓度或延长曝光时间 |
| 信号过曝 | 光源强度过高 | 降低光强或开启自动曝光模式 |
| 通道串色 | 光谱重叠或滤光片污染 | 使用互补光谱染料，清洁滤片 |
| 背景高 | 样本中残留染料 | 离心洗涤后重新上样 |
| 活率偏低 | 染色时间过长 | 缩短染色时间或降低染料浓度 |
| 无法识别荧光信号 | 通道未启用或滤片错误 | 检查通道设置与滤光片匹配 |
| 图像不清晰 | 焦距偏差 | 重新聚焦或清洁玻片 |
十、数据管理与合规性
荧光模式数据可按项目或样本编号自动存档，便于长期管理与溯源。
系统在导出文件中嵌入时间戳、通道配置与操作者信息，满足实验室数据完整性要求。
支持 CSV 数据在 Excel、GraphPad、R 等平台进行进一步统计分析。
荧光图像具备唯一哈希编码，保证结果不可篡改，适用于 GLP 或 GMP 环境下的数据保存。
十一、荧光模式在科研与产业中的应用
细胞治疗研发：用于监测 CAR-T 细胞活率与表面标志物表达。
干细胞培养质控：通过 DAPI/FITC 染色监控细胞分化进程。
药物筛选与毒理研究：利用 AO/PI 检测细胞死亡比例变化。
病毒转导与转染实验：定量 GFP、RFP 表达效率。
单细胞组学样本准备：评估细胞活率与聚集率，确保单细胞质量。
免疫荧光实验验证：快速检测抗体标记效果，替代传统显微定性观察。
荧光模式使 Countess 3 FL 从单纯计数仪升级为高通量微型荧光分析平台。
十二、系统维护与光学保养
为了保证荧光检测的稳定性，需定期执行以下维护：
每周清洁滤光片与载片槽，避免荧光残留。
每三个月检查光源强度，若亮度衰减超过 10%，需更换 LED 模块。
禁止使用含丙酮的清洁液，以防滤镜涂层受损。
保持仪器环境干燥，防止湿度导致光学系统霉变。
定期备份数据，清理无用报告文件。
十三、荧光模式的科学意义
Countess 3 FL 的荧光模式不仅仅是计数扩展，而是一种高通量图像定量技术。
它将显微荧光分析、统计算法与数据可视化融合，使实验者能够：
在几秒内获得细胞生理状态与分子信号分布的量化结果；
替代传统显微镜下的人工计数与主观判断；
提高实验数据的可重复性与标准化水平。
这种模式极大地促进了细胞生物学、药物研发与免疫工程等领域的数据化、自动化进程。
