质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、操作总览与流程逻辑

Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪是一款结合**明场成像（Brightfield）与多通道荧光检测（Fluorescence Detection）**的高性能细胞分析仪。
与基础款 Countess 3 相比，FL 型号在算法与光学系统上增强了荧光激发与检测能力，适用于常规台盼蓝活率检测、GFP/RFP 标记细胞分析、双荧光活死染（AO/PI）判定等多种应用场景。

整个操作过程可分为七个主要阶段：

1. 启动与系统自检

2. 样本制备与染色

3. 计数玻片准备与加载

4. 参数设置与模式选择

5. 自动聚焦与图像采集

6. 数据统计与分析

7. 报告保存与系统维护

每个阶段均有对应的细节要求与标准化操作步骤，以确保数据的准确性和重复性。

二、仪器启动与系统准备

1. 开机与自检

• 接通电源后，按下电源键，系统自动启动并进入自检模式。

• 屏幕显示 LOGO 后，仪器进行光源、相机、镜头与焦距模块的检测。

• 自检完成后，屏幕进入主界面（含“Count”“Settings”“Results”等选项）。

• 若检测异常（如光源故障、镜头未响应），系统会提示错误代码。此时需重新启动或联系技术支持。

2. 环境要求

• 操作温度建议在 18–28 °C，湿度 40–70% 范围内。

• 放置于平稳、无振动的实验台上，避免阳光直射与强电磁干扰。

• 光学窗口周围保持清洁，防止灰尘影响成像质量。

3. 系统初始化

• 首次使用或固件更新后，需设置系统语言、时间格式、日期与网络连接方式。

• WiFi 可用于云端同步与报告上传。

• 检查 USB 存储设备是否插入，以便后续导出数据。

三、样本制备与染色步骤

样本准备的质量直接决定计数与荧光检测结果的可靠性。FL 型号可支持明场与荧光双模操作，故样本制备需区分两种模式。

1. 明场模式样本准备（常规计数）

• 收集悬浮细胞或消化后的贴壁细胞，离心去除培养基。

• 重悬细胞于适量 PBS 或培养基中，使浓度处于 1×10⁵–4×10⁶ cells/mL。

• 如需检测活率，加入 0.4% 台盼蓝染液，按 1:1 混合比例（例如 10 µL 细胞 + 10 µL 染液）。

• 混匀后立即上样，避免长时间放置导致染色进展或细胞死亡。

2. 荧光模式样本准备（AO/PI 或其他荧光检测）

• 取细胞悬液离心去上清，重悬于无血清缓冲液中。

• 加入 AO/PI（Acridine Orange / Propidium Iodide）或相应的 GFP/RFP、FITC、DAPI 染料。

• 按说明比例混合，一般 1–5 µL 染料加入 100 µL 细胞悬液。

• 避光孵育 2–5 分钟后轻轻混匀，准备上样。

• 若检测多通道信号，建议使用单染样本进行通道校准。

3. 样本浓度控制

• 若浓度过高，细胞重叠会降低识别精度，可稀释至推荐范围。

• 若浓度过低，统计样本数不足，误差增大。一般建议在单帧 100–500 个细胞为宜。

四、计数玻片准备与加载

1. 计数玻片类型

Countess 3 FL 可使用两种玻片：

• 一次性计数片：预装盖片设计，使用方便，无需清洗。

• 可重复使用玻片：适合大量样本分析，需定期清洁维护。

2. 上样步骤

• 取 10 µL 样本溶液加入计数腔入口，液体应自然填满计数区。

• 确保无气泡、无溢出，液层均匀。

• 将计数片插入仪器载片槽，方向正确（通常印有箭头指示）。

• 待样本稳定后再启动测量，以避免流体扰动。

3. 清洁注意事项

• 每次操作前检查载片槽是否清洁干燥。

• 若使用可重复玻片，上样后立即用去离子水冲洗并用乙醇擦拭。

• 防止残留染料污染光学系统。

五、模式选择与参数设定

Countess 3 FL 提供明场（Brightfield）与三通道荧光检测（Green / Red / Far Red）。用户可根据实验需求设定参数。

1. 模式选择

• 在主界面选择 “Count” → “Mode”，系统显示 “Brightfield” 或 “Fluorescence”。

• 若选择荧光模式，可勾选单通道或双通道检测（如 Green+Red）。

2. 自动参数（Auto Mode）

• 系统默认采用自动聚焦与自动曝光模式，适用于大多数样本。

• 仪器将自动调节亮度、焦点、增益等参数以获得最优信噪比。

3. 手动参数（Manual Mode）

在需要精准调整时，用户可进入手动界面：

• Focus（对焦）：通过滑动条调整焦距，观察细胞边缘清晰度。

• Exposure（曝光）：调节亮度与对比度，避免过曝或暗淡。

• Threshold（阈值）：针对荧光信号强度设置识别界限。

• Size Range（尺寸范围）：排除碎片与聚集体的干扰。

4. 模板保存

• 当找到理想参数组合后，可点击“Save Template”保存为模板。

• 下次测量相同类型细胞时直接调用，保持一致性。

六、自动聚焦与图像采集

1. 自动聚焦过程

• 系统通过多点扫描算法自动识别焦平面。

• 若图像边缘模糊，可手动微调焦距。

• 完成聚焦后，系统自动锁定焦点并进入图像采集阶段。

2. 图像采集

• 仪器拍摄明场与荧光图像，并叠加显示。

• 图像中：

• 明场显示细胞形态；

• 绿色通道代表活细胞或 GFP 阳性信号；

• 红色通道代表死细胞或 PI 阳性信号。

• 采集完成后，系统启动识别算法，数秒内输出计数结果。

3. 识别显示

• 活细胞以绿色轮廓标注，死细胞以红色线框显示。

• 聚集体被单独标识为黄色或蓝色区域。

• 右侧数据面板同步显示统计结果。

七、数据统计与分析

仪器自动生成多项统计数据，包括：

1. Total Cells（总数）：识别到的所有细胞数量。

2. Live Cells（活细胞）：未染色或仅发出绿色荧光的细胞。

3. Dead Cells（死细胞）：发出红色荧光或染色信号的细胞。

4. Viability（活率%）：

   Viability=LiveLive + Dead×100%\text{Viability} = \frac{\text{Live}}{\text{Live + Dead}} \times 100\%Viability=Live + DeadLive×100%

5. Cell Concentration（细胞浓度）：
   自动根据体积与稀释系数计算。

6. Average Diameter（平均直径）：用于评估细胞生长状态。

7. Aggregate Percentage（聚集体比例）：反映样本分散性。

此外，屏幕可显示：

• 细胞尺寸分布直方图；

• 活死细胞比例条形图；

• 多通道荧光叠加图像。

八、结果导出与报告生成

1. 数据保存

计数完成后，用户可选择：

• “Save Result” 保存至内部存储；

• “Export to USB” 将数据导出为 CSV 与图像文件；

• “Create PDF Report” 生成图像与统计表结合的完整报告。

2. 文件内容

导出的文件通常包含：

• 样本名称与编号；

• 操作者、时间与仪器编号；

• 细胞浓度、活率、聚集比例等；

• 图像缩略图与荧光通道示意图。

3. 文件命名规则

系统默认使用样本名加时间戳命名，如：
Jurkat_FL_2025-10-30_15-24-50.csv。
命名规则可在设置中自定义。

4. 数据兼容性

CSV 文件可在 Excel、R、Python 或实验室信息系统（LIMS）中直接读取；
PDF 报告可用于审查与归档。

九、荧光检测应用扩展

Countess 3 FL 可进行以下类型的荧光实验：

1. AO/PI 双染活死判定

• AO 染色核酸呈绿色荧光，PI 进入死亡细胞后呈红色荧光。

• 系统可自动区分活细胞、死细胞及双阳性异常信号。

2. GFP/RFP 表达检测

• 适用于转染效率评估与报告基因筛选。

• 可在“Green/Red Channel” 中设置双通道识别，输出阳性比例。

3. DAPI 或 Hoechst 染核实验

• 用于核计数或细胞周期前期样本检测。

4. 免疫荧光标记验证

• 可检测表面标志物或胞内蛋白荧光信号强度分布。

通过选择不同滤光片组合，仪器能同时实现三通道观测，为多参数细胞分析提供支持。

十、常见问题与解决方法

以上故障处理在文档中以流程形式呈现，用户可根据提示逐步排查。

十一、维护与关机步骤

1. 日常维护

• 每天操作结束后，用去离子水和乙醇清洁载片槽。

• 擦拭屏幕与外壳，保持无尘干燥。

• 检查样本残留，防止污染。

2. 定期维护

• 每月执行一次系统校准；

• 检查光源亮度与成像均一性；

• 清理内部风道与接口灰尘。

3. 软件维护

• 定期检查固件更新；

• 备份全部实验数据；

• 清理旧报告以释放存储空间。

4. 关机流程

• 返回主菜单，点击“Shutdown”；

• 等待系统提示“Safe to Power Off”后再断电；

• 若长期停用，拔下电源线并覆盖防尘罩。

十二、安全注意事项

1. 染料如 PI、AO 属致敏或潜在致癌物，操作时佩戴防护手套与眼镜。

2. 避免在强光环境下使用荧光模式，以防光路干扰。

3. 若检测生物危害样本，务必使用一次性玻片并按生物废弃物处理。

4. 不得自行拆卸仪器部件，维护需由授权工程师执行。

十三、操作优化建议

1. 样本均一化：充分混匀后立即上样，减少沉降导致的浓度误差。

2. 曝光与增益平衡：调整曝光时间以获得适度信号强度，防止过饱和。

3. 模板管理：为不同细胞类型建立独立模板，提高统计一致性。

4. 重复测定：每批样本至少测两次，计算平均值以降低随机误差。

5. 数据归档：统一命名与保存路径，便于长期趋势分析。

十四、工作流程简要示意

此流程贯穿从样本到数据的全程，确保操作规范化。