质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、性能验证的意义与总体目标

在细胞分析领域，细胞计数和活率评估的准确性直接决定后续实验的质量与可重复性。Countess 3 Automated Cell Counter 作为一款采用机器学习算法和高分辨率成像的全自动细胞计数仪，其性能验证旨在回答三个核心问题：

1. 仪器能否在不同操作者、不同样品、不同浓度下保持计数一致性与线性？

2. 自动算法在活/死区分、聚集体识别、直径测量方面与传统手工血球计数板相比，是否具备相当或更优性能？

3. 长期使用下，系统是否维持稳定、无需频繁校准即可输出可追溯的数据？

性能验证的最终目标，是建立一套可量化、可追踪、可复现的基准，以确保仪器结果符合科学实验、工艺开发、质量控制等环节的使用要求。

二、技术特性与验证依据

Countess 3 基于数字成像和深度学习图像识别算法，其核心性能参数包括：

• 成像系统：500 万像素 CMOS 相机，2.5× 光学放大倍率，明场成像模式（Countess 3 FL 另含荧光通道）。

• 测量范围：1 × 10⁴ – 1 × 10⁷ cells/mL。推荐范围 1 × 10⁵ – 4 × 10⁶ cells/mL。

• 样本体积：10 µL （单次计数）。

• 测量时间：约 20 – 30 秒。

• 检测对象直径：4 – 60 µm。

• 输出参数：总细胞浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、活率 %、平均直径、聚集体比例、图像分布数据。

• 算法能力：自动对焦、自动亮度控制、细胞聚集体识别与剔除、碎片过滤。

性能验证的关键在于对这些参数的量化确认：验证仪器能否在标称范围内运行并达到精度、重复性和灵敏度要求。

三、验证计划与设计思路

性能验证通常由三个层面组成：

1. 初步验证（Installation & Operational Qualification，IQ/OQ）：确保仪器安装正确、系统功能完整、显示界面及图像采集功能正常。

2. 性能验证（Performance Qualification，PQ）：通过标准颗粒或标准细胞样本，验证其计数准确性、线性、重复性和活率识别性能。

3. 持续验证（Ongoing Verification）：在常规实验使用中，定期用标准样本复核性能，以监控长期稳定性。

以下章节将以 PQ 为核心，对 Countess 3 的性能指标进行详细阐述。

四、准确度验证（Accuracy Validation）

准确度即计数结果与真实值或参考方法结果的接近程度。

1. 对比基准

常用的参考方法为：

• 血球计数板（Hemocytometer）手动计数法；

• 流式细胞仪（Flow Cytometer）计数法；

• 标准微球（Count Beads）方法。

2. 实验步骤

• 准备标准化细胞悬液（如 Jurkat 或 HEK293 ），浓度经手工计数确定。

• 取不同浓度梯度样品（1 × 10⁵、5 × 10⁵、1 × 10⁶、2 × 10⁶、4 × 10⁶ cells/mL）。

• 每个浓度分别测定三次，计算平均值。

• 对比仪器测值与手工计数参考值，计算偏差百分比 %Bias = (仪器值 – 参考值)/参考值 × 100%。

3. 验证标准

若偏差在 ±10% 以内，判定为符合精度要求；在 ±5% 以内则为优良等级。实际测试表明，Countess 3 的偏差多数集中在 ±3 % 范围内，优于传统手工计数。

4. 结果分析

自动算法有效过滤碎片、团聚和背景噪点，使其对样本的变化不敏感。通过平均图像识别结果验证，Countess 3 在中等浓度范围内的准确性高于 95 %，尤其在死细胞比例低于 20 % 的健康培养样本中表现最为稳定。

五、精密度与重复性（Precision and Repeatability）

1. 定义

精密度反映同一样本重复测定结果的一致程度，常用相对标准偏差（RSD %）或变异系数（CV %）表示。

2. 实验设计

• 选取单一浓度细胞悬液，重复测定 10 次。

• 同一操作者与不同操作者分别测试，评估操作员间差异。

• 分析每次测定的浓度、活率、直径结果。

3. 典型结果

• 单仪器重复测定：CV 通常 < 3 %。

• 多操作者间差异：CV < 5 %。

• 与手动血球计数对比，手动操作的CV 约 10 – 15 %，可见仪器显著降低主观误差。

4. 结果解读

Countess 3 的自动聚焦和算法门限使其操作标准化，消除了手动计数中“视野选择偏差”和“边界模糊”等主观因素，是实验室流程标准化的重要基础。

六、线性与灵敏度验证（Linearity & Sensitivity）

1. 验证目的

确认仪器输出结果与输入浓度呈线性关系，并能在标称范围内准确响应浓度变化。

2. 方法

制备多个浓度梯度的细胞悬液（从 1 × 10⁴ 到 1 × 10⁷ cells/mL），测得仪器读数并绘制校准曲线，拟合直线方程 Y = aX + b 。

3. 评价指标

• 线性相关系数 R² ≥ 0.99 为理想；

• 检测下限（LOD）约 1 × 10⁴ cells/mL；

• 超高浓度 (> 1 × 10⁷ cells/mL) 可能因重叠造成低估。

4. 结果特征

在 1 × 10⁵ – 4 × 10⁶ cells/mL 范围内，Countess 3 保持完美线性；超过上限时可自动提示样本需稀释。灵敏度足以检测到低浓度样本（如早期培养物或稀释实验）。

七、活/死细胞判别性能验证

1. 验证思路

使用染料（如 0.4% 台盼蓝）或荧光双染体系（FL 机型）检测活/死比例，并与流式分析或显微评估结果比对。

2. 实验流程

• 选取健康细胞（活率 > 95 %）与经热处理或化学杀死的死细胞（活率 < 10 %）混合，形成不同活死比例（10 %、30 %、50 %、70 %、90 %）。

• 仪器计数并自动生成活率数据。

• 将结果与流式细胞术测值比较。

3. 验证标准

相对误差 ≤ 5 %，相关性 R² ≥ 0.98 视为合格。结果显示，Countess 3 在 10 % 至 90 % 活率区间内判别准确，曲线近乎与参考方法重合。

4. 关键机制

深度学习模型在图像识别中可区分亮度与形态特征，通过台盼蓝吸收差异和细胞完整性实现自动分类，减少因光照不均造成的误判。

八、聚集体识别与碎片排除性能

1. 问题概述

细胞团聚或碎片常是手工计数偏差的主要来源。仪器需具备识别并剔除聚集体与碎片的能力。

2. 验证步骤

• 制备不同程度的聚集样本（通过轻度震荡或离心获得）。

• 仪器自动计算聚集体比例并输出。

• 对比显微镜实测值，计算聚集体识别率。

3. 结果分析

Countess 3 对聚集体的检测准确率超过 95 %，误报率低于 3 %。同时能根据直径与形状因子自动排除碎片，提高净计数精度。

4. 实际意义

在单细胞研究或下游分选应用中，聚集体检测性能直接决定样本放行标准。Countess 3 的聚集比例数据已成为多实验室单细胞质控指标之一。

九、不同细胞类型的性能验证

1. 贴壁细胞

在 CHO、HEK293、NIH-3T3 等贴壁系中，胰酶脱附后颗粒尺寸较均一，仪器计数准确率高达 97 %。
平均直径测量与显微观察一致，偏差 < 1 µm。

2. 悬浮细胞

针对 Jurkat、K562、PBMC 等悬浮系，验证结果显示，算法能在背景碎片较多的情况下保持良好识别；与流式计数结果 R² = 0.992。

3. 原代细胞

原代细胞异质性大，Countess 3 在自动模式下仍可稳定检测 4 – 60 µm 范围个体。通过适当调节亮度与尺寸阈值，可避免过度排除。

4. 干细胞与球体解离样本

在 iPSC、MSC 等干细胞系中，经过充分重悬后仪器可准确计数。对于类器官或球体解离产物，聚集体识别尤其重要，平均聚集体识别精度 > 90 %。

5. 单细胞测序样本

Countess 3 在单细胞文库制备前的质控应用中，活率与聚集体数据与 10x Genomics 推荐范围高度一致，活率偏差 < 3 %，聚集体识别差异 < 1 %。

十、系统稳定性与长期性能监测

1. 长期漂移检测

• 连续运行 3 个月，每周使用标准珠样本复测。

• 测定平均值与初始值偏差。
  结果显示：三个月内读数漂移 < 2 %，说明仪器无需常规校准即可保持稳定。

2. 环境适应性

在温度 18 – 28 °C、湿度 40 – 70 % 条件下运行，计数误差变化不显著，仪器对实验室环境容忍度高。

3. 光学系统耐用性

光源亮度衰减测试（模拟 5000 次计数）表明图像亮度下降 < 3 %，不会影响算法识别。

4. 软件算法更新

系统支持定期算法更新，确保兼容更多细胞类型。验证发现不同软件版本之间的输出差异 < 1 %，说明更新不会破坏数据一致性。

十一、性能验证的质量控制要点

1. 使用标准化样本：选择参考细胞系或标准微球，建立长期对照体系。

2. 定期性能复核：建议每周进行一次精密度检测，每月进行一次线性与活率对比。

3. 仪器维护：保持光路与计数板槽清洁；可重复玻片定期更换。

4. 数据追踪与存档：所有验证数据（图像、CSV 、PDF 报告）需保存，便于回溯与趋势分析。

5. 异常报警机制：若活率波动 > 10 %、聚集体比例异常升高、漂移超过阈值，应暂停使用并排查样本准备与光学系统。

6. 交叉验证：每半年使用手工计数或流式计数进行对照验证，确认系统未出现系统性偏差。

十二、性能局限与风险控制

尽管 Countess 3 性能优秀，但仍存在局限性：

• 对极端高浓度样本（> 1 × 10⁷ cells/mL）或极低浓度样本，可能需人工稀释或多次计数。

• 在大量碎片或强背景噪声（如组织消化液）中，可能需要人工优化阈值。

• 对于超小颗粒（直径 < 4 µm）的检测能力有限，不适用于细菌或亚细胞颗粒。

• 若玻片表面不洁或液层不均，将导致光学失真，应在 SOP 中严格限定清洁步骤。

通过在样本准备与光学维护上保持一致性，可大幅降低这些风险。

十三、综合性能结论

综合多轮验证结果，Countess 3 在核心性能指标上表现如下：

这些数据表明，该设备完全可满足科研、制药、细胞工艺开发等多层次应用中的计数与质控需求。

十四、性能验证后的应用价值

通过系统性能验证，实验室可基于 Countess 3 建立标准化细胞质控体系：

1. 研究阶段：保障实验重复性，减少主观偏差；

2. 工艺开发阶段：可量化细胞密度与活率数据，为上游培养与下游分析提供基础输入；

3. 细胞治疗研发：形成一致性强的 QC 流程，用于 PBMC、CAR-T、iPSC 等细胞的活率与聚集控制；

4. 单细胞组学与转录测序前处理：确保样本符合单细胞捕获标准；

5. 教学与培训：性能验证数据可作为仪器操作规范的培训教材。

十五、性能验证流程的制度化建议

为维持长期稳定运行，建议实验室建立如下制度化框架：

1. SOP 体系：明确安装、验证、使用、清洁、复核、报修、停机等操作步骤。

2. 验证周期：首次安装后进行完整 PQ 验证；之后每 6 个月或软件/硬件更换后重新验证。

3. 文档管理：保存验证计划、原始数据、统计分析、偏差记录及结论报告。

4. 责任分工：指定负责人执行定期复核与维护，确保跨人员操作一致。

5. 培训机制：所有操作者需通过性能验证标准培训并签署记录。