质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、样品准备总体思路

在使用 Countess 3 进行细胞计数前，样品准备是关键环节。优质的样品准备可大幅提升计数准确性、重复性和仪器识别效率。从宏观来看，样品准备可分为两个阶段：

1. 初级制备阶段——从培养瓶、冻存管、生物组织等获取细胞悬液，并使其达到适于计数的状态（如充分重悬、去除碎片或团聚、适当浓度）。

2. 计数前处理阶段——将悬液稀释或染色至合适体积、浓度并装载至计数板，确保仪器可快速、准确识别细胞。

整个流程的目标是：获得均匀、无大团聚、符合浓度范围、背景清洁、染色合适的样本。以下各节将细化每一步骤。

二、初级制备阶段

2.1 细胞来源与收集

根据细胞的类型（贴壁细胞、悬浮细胞、原代细胞、冻存复苏细胞等），收集方式有所不同：

• 贴壁细胞：通常先观察细胞适合传代或处理状态，吸去原培养液，用适量 PBS 或胰酶/分离液处理（如 Trypsin/EDTA）以脱离贴壁，然后中和、离心、重悬。

• 悬浮细胞：直接从培养瓶或离心管取出细胞悬液，离心去除旧培养液或上清，重悬于新培养液或合适缓冲液。

• 冻存细胞复苏：将细胞从液氮管复苏后计数前，需养护一段时间（如 12-24 小时）使细胞恢复状态，再采集。

• 原代细胞或组织来源：可能需要消化、筛选、离心、红细胞裂解、清洗等预处理步骤，以获得悬浮单细胞状态。

2.2 混悬与均匀化

• 将细胞重悬于缓冲液（如 PBS 含少量 BSA/EDTA 或完整培养液）中。重悬时建议轻吹打数次（例如用移液器上下吹打 5-10 次），确保细胞从沉积状态转为均匀悬浮。

• 避免剧烈摇晃或强烈震荡，以免造成细胞碎片或破损。

• 若观察到明显细胞团聚、粘连或沉降，应先通过轻微离心（如 300×g、5 min）去除上清，重悬于新缓冲，并考虑使用滤网（如 40 µm 或 70 µm）进行轻微筛除聚集体。

• 校核悬液是否均匀：可将悬液轻轻转至新管中，看沉降情况是否一致，底部无明显大块沉积。

2.3 调整浓度

• 为了确保仪器检测性能处于最佳状态，建议将样本浓度调整至 1 × 10^5 至 4 × 10^6 cells/mL 。该范围为官方推荐的最佳工作浓度区间。

• 若浓度过高（>4 × 10^6 cells/mL），建议按一定倍数稀释（如 1:2、1:5 或 1:10）直至进入合适区间。注意稀释时须使用同一缓冲液，并在稀释后轻轻混匀。

• 若浓度过低（<1 × 10^5 cells/mL），可考虑增加样本体积、离心浓缩或合并多个管，确保后续统计量足够。

• 在稀释过程中，建议记下稀释倍数，以便在仪器测得浓度后还原至原始浓度。该信息将纳入数据记录。

2.4 消除碎片与杂质

• 细胞悬液中常含有：死细胞碎片、细胞外基质残留、纤维、气泡或未消化残余。若未清除，这些会干扰仪器识别，导致假计数或漏计。

• 建议在重悬后观察样本：视野中是否有明显气泡、纤维或大块漂浮物。若有，应轻吹打并静置 30 秒，让气泡上浮或沉淀物下沉，再取上清进行计数。

• 若碎片量高、悬浮物多，建议采用低速离心（200-300×g、3-5 min）去除残渣，再重悬。

• 若样本特别易于团聚（例如免疫细胞扩增、原代细胞），建议在离心后重悬时加入少量去粘剂（如 EDTA 0.5 mM）或使用轻微筛网预处理。

2.5 样本稳定与等待

• 在完成悬浮、调浓、清杂后，让样本静置约 10-20 秒，使细胞沉降进焦平面（特别贴壁脱附后的细胞可能尚处于漂浮初期）。 

• 避免长时间等待 (>2-3 min)再上样，以防细胞沉降不均、团聚或恢复贴壁状态。强烈建议混匀后即刻上样。

• 在计数前确认管壁未有明显沉积、上清透明且无大量泡沫。若发现沉积或漂浮大颗粒，应轻吹打重新混匀。

三、计数前处理阶段

3.1 染色（活/死分辨）

• 对于常规活率测定，多采用 0.4% 台盼蓝染液。样本与染液典型混合比例为 1:1 （例如 10 µL 细胞悬液 + 10 µL 台盼蓝）。

• 操作步骤如下：取适量细胞悬液（通常 10 µL）→ 与 10 µL 台盼蓝混合 → 轻轻上下吹打数次混匀 → 立即加载计数板。注意：混合完成后应尽快上片，以避免染色时间延长导致指标偏差。

• 若进行荧光染色（仅适用于 Countess 3 FL 型号），如用 AO/PI、CellEvent Caspase 染料、GFP/RFP报告等，应严格按其染色说明进行，不论染色时间、温度、荧光通道暴露、洗涤步骤。并建议先做阳性/阴性对照以设立荧光阈值。

• 在染色后若发现大量死细胞或碎片，应考虑延长洗涤/离心步骤或更换缓冲液，以改善样本质量。

3.2 稀释与体积准备

• 完成染色后，通常总体积为 20 µL（例如 10 µL 细胞悬液 + 10 µL 台盼蓝）。如需进一步稀释，可在此基础上加入缓冲液，但应重新计算稀释倍数。

• 若细胞浓度极高，亦可先做预稀释（如 1:5、1:10）再与染液混合，以避免样本过浓导致计数错误。

• 稀释时应使用同样类型缓冲液，避免引入新杂质或变更渗透压。混合后再次轻吹打混匀。

3.3 计数玻片/载具准备

• Countess 3 配套一次性计数玻片或可重复使用玻片两种。用户需根据实验预算、废弃物处理能力选择。 

• 一次性玻片：打开包装后直接使用，避免触碰视窗。确保无划痕、无污染。

• 可重复玻片：在首次使用前需严格清洁，使用后每次需及时清洗（建议用去离子水 + 70% 乙醇擦拭 + 无尘纸擦干），避免残留干燥染液或蛋白沉积。

• 填样前检查玻片下层是否干燥、盖玻片是否正确贴合（若或有盖玻片结构）、载架是否干净。

• 若使用可重复玻片，应记录使用次数或维护状态，避免长期使用导致划痕、玻璃疲劳、影像模糊。

3.4 样本加载

• 使用移液器精确移取混合样本体积（推荐 10 µL）进入计数板样本入口。避免气泡进入；若有气泡，应轻轻吹打或更换移液器再试。样本应自然通过毛细作用填充计数腔（区域约 2.26 mm × 1.69 mm）。一次性玻片一般有指示线或倒置样式，避免样本未满或溢出。

• 加载后建议静置约 30 秒，让细胞沉降并处于焦平面。避免立即操作以减少流体扰动。

• 插入玻片至仪器时，应听到“卡入”声或确认滑轨锁定，防止晃动造成成像错误。

3.5 检查预览（建议）

• 插入后，在仪器预览界面（若存在）观察样本整体情况：检查是否有大团聚体、空气气泡、液层不均、沉淀物、杂颗粒。

• 若发现明显问题（如 >5% 聚集、气泡、漂浮颗粒），建议取出玻片、重做样本准备。 

• 一些高要求流程（如单细胞分析）建议在此阶段确认“聚集体<5%”为合格标准。

四、常见情况与特殊样本处理

4.1 易粘连/团聚细胞

• 免疫细胞（如 T 细胞、PBMC）、原代成纤维或肿瘤系经常出现粘连。建议在重悬时加入少量 EDTA（0.5-1 mM）或使用轻度机械打散（移液器上下吹打10次）再重悬。

• 对于严重成球细胞或悬浮球体（如神经球、干细胞球体），建议在计数前用轻度酶解或筛网分离至单细胞状态。

• 若仍有聚集体，建议在 Countess 3 中查看聚集比例，并将此比例记录为质量指标。

4.2 贴壁脱附细胞

• 脱附步骤必须彻底。贴壁细胞在未充分脱附状态下上计数板，会导致细胞簇或贴壁残留。建议胰酶/EDTA作用足够时间：通常 2-5 min，根据细胞系而定。

• 脱附后用培养基或等体积中和液终止酶作用，并离心（如 300×g、5 min）去除酶液，重悬至所需浓度。

• 检查是否有附着细胞残留于瓶壁或脱落不完全的大块结构。移除大块残留后再计数可提升准确性。

4.3 冻存复苏细胞

• 复苏后至少培养 12-24 小时，使细胞恢复平贴或悬浮状态、恢复增殖能力、减少细胞死亡比例。

• 复苏后的第一计数优选在培养后稳定期（如第 2 代或第 3 代）进行，使得细胞状态更均一、碎片或死亡剩余减少。

• 在复苏后首次计数，可作为基线记录，后续实验比对时参考用。

4.4 原代样本与组织来源

• 原代细胞经常含有碎片、血细胞、基质残留物等杂质。建议：离心、洗涤、红细胞裂解、滤网预处理。

• 建议在加载前做显微镜检查，判断是否需额外处理。若杂质过多，建议不直接计数，而是先预清洗。

• 由于细胞异质、尺寸差大，应在 Countess 3 使用前预调参数（如尺寸下限较低、圆度门限放宽）以适应多形态群体。

4.5 单细胞分析／细胞核计数

• 若用于 scRNA-Seq、scATAC-Seq 等下游应用，样本质量要求更高：活率高、聚集体极少、尺寸分布窄。 

• 在样本制备时，建议通过 Countess 3 先测定“聚集体比例”指标，确认 <5% 为合格。如 >5%，返工。

• 样本经常需要额外筛网（例如 35 µm）或轻度超声/机械打散，确保高度单细胞状态。

• 膜裂或核分离样本（用于 snRNA）亦建议染色或使用 FL 模式，提高识别可靠性。

Five、样品记录与溯源

• 每次计数前建议记录样本信息：细胞系／来源、代次、培养瓶号、处理条件、稀释倍数、染色比例、计数时间。

• 将稀释计算、染色细节、样本体积、上样时间、玻片类型、操作员等录入实验日志。

• 建议将计数结果（浓度、活率、聚集体比例、平均直径）与样本准备条件关联，从而分析准备流程对结果的影响。

• 若用于关键流程（如细胞治疗、单细胞文库构建），建议将样本准备流程纳入 SOP，并做条码或标识，以便回溯。

六、典型流程示例

以下是一个贴壁细胞转染后计数的样品准备流程示例：

1. 观察贴壁细胞达 70-80% 融合，准备脱附。

2. 吸去培养液，加入 0.25% 胰酶/EDTA，37 °C作用 3 分钟，观察细胞脱附。

3. 加入等体积培养基中和胰酶，离心 300×g 5 分钟。

4. 吸去上清，重悬于新的培养基至约 1 × 10^6 cells/mL。

5. 将细胞悬液混匀后取 10 µL ，与 10 µL 0.4% 台盼蓝混合。

6. 移取混合液至一次性计数玻片，静置 30 秒，插入 Countess 3 并启动 Rapid Capture 模式。

7. 获取结果：细胞浓度（cells/mL）、活率、平均直径、聚集体比例。若浓度偏高 (>4×10^6) 或聚集体比例高 (>5%)，则回到第 4 步重新稀释/重悬。

8. 保存结果，导出 CSV 文件，并将样本准备条件与数据关联存档。

七、常见错误与纠正措施

• 细胞沉降慢：导致上样后细胞未落到焦面。纠正：延长静置至 60 秒或轻轻吹打混匀。

• 气泡进入计数腔：可能导致识别错误。纠正：使用移液器缓慢下加样，避免快速释放。

• 样本浓度过高：重叠严重、聚集多。纠正：稀释 2-5 倍，重新混匀。

• 聚集体比例高：影响计数准确。纠正：使用滤网、吹打、加入 EDTA、减少悬浮时间。

• 染色时间过长或不均匀：导致死细胞误判。纠正：严格按比例、立即加载、避免预先混放。

• 玻片污染或划痕：影像模糊、识别困难。纠正：更换玻片或清洁可重复玻片，并定期检查。