赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter实验流程
质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司
一、实验准备
1. 仪器安装与环境准备
将仪器平稳放置于水平实验台上，避免震动。仪器后方应保留至少 5 cm 空间，以保证通风。
避免将仪器直接置于强光（例如窗户直射）下，避免环境光干扰成像。
插入电源、连接USB存储设备（若需结果导出）或确保网络/WiFi连接（若使用云端存储功能）。
开机后，按照首次使用提示设置日期、时间、（如有）登陆账户、网络连接等。
检查仪器界面，确定触控屏正常、USB端口可用、滑轨插槽畅通。
2. 样本与耗材准备
准备细胞悬液，根据实验目的（例如细胞传代、活率检测、单细胞预处理）从培养瓶中收集并重悬。
推荐将细胞浓度调整至仪器的最佳计数范围：约 1×10^5 至 4×10^6 cells/mL（仪器标称最低可至 1×10^4 cells/mL，最高可至 1×10^7 cells/mL）以获得更佳结果。
若进行活／死细胞测定，准备 0.4% 台盼蓝（trypan blue）染液，与细胞混合。
选择计数玻片：一次性计数玻片或可重复使用玻片。若使用可重复玻片，请准备清洁用具（70%乙醇、无尘擦纸等）。
对于可重复玻片，预先清洁、无油污、无气泡。若使用盖玻片，应贴好盖玻片，保证流体膜均匀。
样本混匀：离心、重悬时避免大块聚集，轻柔吹打混匀，避免气泡、碎片。
3. 参数与方法预设
在仪器触屏界面中，建议先进入 “Protocols” 或 “Templates”（不同版本命名可能略有不同）界面，加载或设定计数参数（如细胞尺寸范围、亮度、圆度、染色通道等）。
如果仅做明场计数（brightfield），可启用“Rapid Capture”模式，该模式下仪器自动设定焦距、光照、捕捉并计数，简化流程。
若有特殊细胞类型（如极小或易聚集细胞）或荧光染料应用，则可手动调整参数，如亮度、曝光、滤镜（限 FL 型号）等。
若需要分割或稀释计算，可在仪器上使用“Pre-Dilution Calculator”或“Cell Splitting Calculator”工具，输入稀释倍数或目标浓度，仪器自动计算所需体积。
确认将数据保存方式（USB、云端或网络驱动器）设定完毕，便于后续数据导出与记录。
二、实验操作流程
以下流程以常规明场、台盼蓝染色计数为例，适用于贴壁细胞或悬浮细胞的基本活率与浓度测定。若为荧光计数或特殊模式，可在此流程基础上作适当调整。
1. 样本制备
将细胞从培养瓶收集、用适当缓冲液（如PBS或培养基）重悬，混匀。
取出适量细胞悬液。根据预期浓度，可先测粗体积或估算。推荐最终浓度落在 1×10^5 至 4×10^6 cells/mL。
准备染液：通常取台盼蓝 0.4% 稀释液。
将细胞悬液与染液按 1∶1 混合（例如取 10 µL 细胞悬液 + 10 µL 台盼蓝）。混合后轻轻吹打数次，确保细胞与染液充分接触且均匀。
混合后立即进入下一步骤以避免细胞因染色时间过长出现误差。
2. 加载样本至计数玻片
若使用一次性计数玻片：
打开一次性计数玻片包装，安装于仪器相应玻片架。
用移液枪取 10 µL 混合液，轻轻吸入且避免气泡。
将移液枪嘴置于玻片的半月形样本加载区，缓慢释放样本，使样本通过毛细作用进入计数室。避免产生气泡，确保液体覆盖计数区域均匀。
等待约 30 秒，让样本沉降、稳定。
插入玻片架至仪器，直至听到“卡入（click）”声。仪器开始准备测量。
若使用可重复玻片（Reusable Slide）：
在可重复玻片上贴上干净无油污的盖玻片。
用移液枪将 10 µL 混合液加载至样本入口处，依靠毛细作用填充计数室。注意不要过量（每腔最大容量为 10 µL）。
确认液膜为薄而均匀，且无明显气泡或沉积。
将玻片放入可重复玻片载架，载架插入仪器至卡位。
计数完成后，取出玻片并及时清洗：先用水冲洗，再用 70% 乙醇擦拭，最后用无尘擦纸擦干。
3. 启动仪器与计数
若预设了 Rapid Capture 模式，则只需插入玻片即可自动完成灯光调整、焦距调整、图像捕捉与计数；通常在 20–30 秒内完成。
若需自定义参数：插入玻片后可手动选择 “Protocols/Templates”，选择已保存的参数模板，或自行设置亮度、曝光、细胞尺寸范围、圆度阈值等。然后点击 “Count” 启动。
仪器将自动识别样本中的细胞，区分活细胞与死细胞（活细胞一般半透明、死细胞染为深色），标注活细胞为绿色轮廓、死细胞为红色轮廓。仪器还会标出聚集体百分比（若样本中存在细胞群聚）。
计数结果显示包括：细胞总浓度（cells/mL）、活细胞浓度、死细胞浓度、活率百分比、平均细胞直径、聚集体比例、细胞大小分布图/散点图。
4. 结果保存与数据导出
在结果界面点击 “Save” 按钮，选择保存类型：可以保存为结果图像（JPEG/PNG/TIFF）、CSV 文件（可供 Excel／第三方软件分析）、PDF 报告（含表格、图像、轮廓标注）等。
保存位置可为插入的 USB 驱动器、已连结云端账户或网络驱动器。需提前确认设备已连接相应存储目标。
在保存时可为样本命名（例如 “Sample_2025-10-30_A”），便于后续检索。保存后建议立刻备份至实验室 LIMS 或数据库。
若需要做稀释校正或传代计算，可在结果界面点击 “Calculators” 使用“Pre-Dilution Calculator”或“Cell Splitting Calculator”，根据输入体积/浓度计算所需稀释倍数或所需细胞数。
5. 后处理与清理
在完成计数后，正确处置一次性玻片为生物危害废弃物。不要重新使用一次性玻片。
对于可重复玻片，及时清洗并干燥保存。切勿留有残留液体或污染物。
清洁仪器滑槽、触控屏、玻片插入口，以防细胞残留或染料溅落影响下一次测量。清洁建议使用 70% 乙醇或仪器推荐的清洁剂，切勿在开机状态下直接喷液或倒液。
建议定期（如每周或每批十数次计数后）运行标准颗粒（如计数珠）或标准细胞悬液，检查仪器性能、确认计数准确性、识别潜在漂移。
三、数据解读与流程提示
1. 样本浓度与活率判断
若仪器显示浓度远超推荐范围（如 >4×10^6 cells/mL），应考虑稀释样本后重新计数，因为高浓度可能导致细胞重叠、聚集，从而影响准确性。
若浓度远低于推荐范围（如 <1×10^5 cells/mL），也应适当浓缩或更换样本体积，以确保检测统计量充足。
活率指标（活细胞数 ÷ 总细胞数）用于评估样本质量。若活率偏低（例如低于 70%），应考虑细胞状态是否衰老、污染、离心/重悬损失严重，或染色时间过长。
聚集体百分比是一个关键质量控制指标，尤其在下游要求单细胞分析的流程中。若仪器报告聚集体 >5%，建议重新离心、重悬或使用去聚剂处理。例如在单细胞测序前，确保聚集体比例低以提高捕获效率。
2. 使用内置计算器建议
使用预稀释计算器（Pre-Dilution Calculator）可校正样本与染液比例（例如 1∶1 混合台盼蓝）所造成的稀释效应。
使用细胞分割计算器（Cell Splitting Calculator）可根据当前浓度和目标浓度/体积，计算所需样本体积或缓冲加入量，从而优化接种和传代设置。
建议在每次操作前快速运行一次计算器，以保证操作设计一致性。
3. 模式选择与参数优化
若只是快速细胞浓度 + 活率测定，启用“Rapid Capture”即可，无需调整参数。
若样本类型特殊（如非常小细胞、细胞群聚严重、血系细胞、PBMC、细胞核等），建议手动进入“Protocols/Templates”设置更严格的尺寸、圆度、亮度参数。
建议对每个新细胞系或样本类型做一次“优化计数”流程：先用默认参数计数，观察平均细胞直径、聚集体比例、死细胞比例；如识别效果不佳，再调整参数（如降低亮度、缩小尺寸范围、提高圆度门限）。
在使用可重复玻片时，应注意玻片清洁、盖玻片贴合良好、避免气泡、填充界面均匀。一旦出现液膜不均或气泡，可导致焦点偏移、识别错误。
四、注意事项与故障排查
1. 常见注意事项
操作人员在移液取样和加载玻片时应避免气泡、不要触摸光学通道面。样本必须均匀混匀。
样本加载后应尽快插入仪器计数。过长等待或染色时间过长可能导致细胞死亡或沉降、影响活率估算。
玻片两侧样本若为不同样本，应标注明确，避免混淆。仪器通常读取一侧样本。
确保仪器镜头无污染、玻片槽无残液、环境光线适中。避免仪器前方摆放杂物或强反光面。
若保存数据至网络/云端，确保网络稳定；若使用USB，确保USB格式(FAT32/exFAT/NTFS兼容)且有足够空间。
若使用可重复玻片，务必在每次使用后彻底清洗、干燥；并记录使用次数与状态以保障重复使用可靠性。
2. 故障排查建议
若计数结果偏离预期（例如浓度明显偏低或偏高、活率异常、聚集体比例异常），可检查以下：
样本是否混匀、是否有大块团聚或碎片。
样本是否被稀释或浓缩正确。
是否加载气泡或液膜不均。
计数参数是否适合当前细胞类型（例如尺寸门限太大导致碎片被误判为细胞、圆度参数设置不合适导致异形细胞被排除）。
玻片是否清洁、光路是否被遮挡、镜头是否沾污。
仪器软件是否最新、是否有需要校准或运行标准颗粒检测。
若光照不均、图像偏暗或偏亮，可手动调整“光源强度”或“曝光时间”；在可设定模式下（部分模板模式）进行调整。
若长期使用后发现计数不稳定、误差较大，建议使用标准计数珠或标准细胞悬液进行检测，以判断仪器偏差。
