赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter样本体积

赛默飞细胞计数仪 Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter 作为一款智能化全自动细胞分析系统，对样本体积的控制要求极为严格。正确的样本体积不仅关系到细胞浓度换算的准确性，还直接决定成像质量、统计范围与检测结果的可信度。

产品详细

质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

在细胞计数实验中，样本体积（Sample Volume）是影响检测结果准确性和重复性的关键参数之一。
赛默飞细胞计数仪 Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter 作为一款智能化全自动细胞分析系统，对样本体积的控制要求极为严格。正确的样本体积不仅关系到细胞浓度换算的准确性，还直接决定成像质量、统计范围与检测结果的可信度。

仪器通过精确采样和定量成像，将样本体积与检测区域对应，以计算每毫升样品中的细胞数量。如果体积加载不准确或层厚不均，将导致浓度偏差或图像识别错误。
因此，理解样本体积在检测中的作用原理，并掌握标准化操作方法，是实现高质量细胞计数与活性分析的重要基础。

二、样本体积的定义与意义

1. 定义

样本体积是指在一次检测过程中注入计数板检测腔内的液体体积。对于 Countess 3 仪器而言，该体积一般为 10 微升（10 µL）。

2. 意义

样本体积决定了系统所分析样品的总细胞数量与浓度换算系数。
在已知检测腔体积的前提下，仪器通过统计图像中的细胞数并结合样本体积计算每毫升的细胞浓度：

$\frac{N}{V}$

其中：

C 为计算出的细胞浓度（cells/mL）；
N 为检测图像中识别的细胞数；
V 为检测样本体积（mL）。

体积越精确，浓度计算越准确；若体积偏差过大，则会成倍放大检测误差。

三、仪器设计下的体积控制原理

1. 检测腔结构

Countess 3 计数板的检测腔由上、下两层透明板构成，中间为固定厚度的检测间隙。

检测间隙厚度：约 100 µm；
有效检测面积：约 10 mm × 10 mm；
检测腔体积：约 10 µL。

这一定量腔体保证每次检测的体积一致，为算法提供标准化计算基础。

2. 光学采样区域

仪器摄像头捕捉的图像区域与检测腔体积对应。每次成像的视野面积固定，体积偏差会直接影响统计数量。

3. 自动体积换算

系统根据标准腔体尺寸自动换算浓度，不需要用户输入体积值。但如果加样量不足或溢出，会破坏腔体几何结构，使计算失准。

四、标准样本体积要求

1. 推荐体积

每次检测标准样本体积为 10 µL，这是 Countess 3 所设计的最优体积参数。

2. 允许误差范围

操作误差应控制在 ±0.5 µL 以内。
体积偏差超过 ±1 µL 时，结果可能出现 5% 以上的浓度误差。

3. 体积与检测精度关系

实际加载体积	误差类型	对浓度结果的影响
<9 µL	加样不足	浓度被高估
>11 µL	加样过量	浓度被低估
10 µL ±0.2 µL	理想范围	误差小于 1%

可见，保持样本体积的一致性是确保实验重复性的重要前提。

五、样本体积对图像与识别的影响

成像清晰度
若加样不足，样品层厚度降低，光线透过过强，细胞影像模糊；加样过量则导致液体层过厚，光线衰减，图像变暗。
细胞分布均匀性
体积不足会造成局部区域干涸，细胞集中分布；体积过多会引起液体流动，导致细胞漂移聚集。
识别算法稳定性
体积偏差导致成像对比度变化，影响算法的阈值判定，使自动识别准确度下降。

六、样本体积加载操作流程

1. 工具准备

校准过的移液枪（10 µL 规格）；
10 µL 无菌吸头；
Countess 计数板（一次性或可重复使用型）。

2. 操作步骤

混匀细胞悬液，防止沉降；
吸取 10 µL 样品，确保液体平滑进入吸头；
缓慢将液体注入计数板进样口，使液体均匀充满腔体；
检查是否形成气泡，如有气泡需重新加载；
将计数板放入仪器样品槽中；
启动检测。

3. 注意事项

加样角度应保持 45°–60°；
加样速度保持平稳，避免液体冲击；
加样完成后等待 3 秒，让液体充分铺展。

七、体积误差的常见原因与预防

问题现象	原因	预防措施
加样不足	吸头内残留或加样过快	使用新吸头并保持匀速操作
样品溢出	吸液量超标或倾斜注入	控制体积在 10 µL，垂直注入
气泡存在	加样过快或吸头接触不良	调整速度并避免触碰底面
液层不均	样品腔未完全填满	检查液体铺展情况后检测

保持操作一致是减少体积误差的最有效方法。

八、不同类型计数板的体积控制

1. 一次性计数板

该类型板内部腔体固定，加载 10 µL 即可充满检测区。若加样不足，液体无法覆盖整个区域；若加样过量，液体可能外溢。

2. 可重复使用计数板

此类型需人工清洁。使用时应确保计数腔干燥、无残液。样品体积同样为 10 µL，但应更注意避免气泡。

3. 双腔结构计数板

部分版本具有两个独立检测腔，可一次检测两个样品。此时应分别注入 10 µL，保持两腔体积一致以确保对比实验准确。

九、样本体积与稀释倍数计算

在细胞计数中，若样品经过稀释处理，需结合体积换算原始浓度。

例如：
样品稀释 1:2 后检测浓度为 5×10⁵ cells/mL，原始浓度计算为：

$\text{ cells/mL}$

因此，保持加载体积一致能确保稀释系数换算的线性准确性。

十、体积与活性分析的关系

在进行台盼蓝染色的活性检测时，样本体积的准确性同样关键。
如果体积偏小，部分死细胞可能集中分布而被过度识别；体积偏大则使染料浓度降低，导致死细胞染色不足。

标准操作要求：

染色后混合均匀；
每次取样体积仍为 10 µL；
确保染料比例与检测体积一致。

通过体积控制，可提高活细胞与死细胞判定的可靠性。

十一、样本体积对统计结果的影响

1. 采样代表性

固定体积保证每次检测统计的细胞数量处于理想区间（约 500–2000 个细胞/视野）。
若体积偏差导致统计数量过低，样本代表性下降，标准误差上升。

2. 数据重复性

体积控制良好的检测，其重复性误差通常低于 5%。
若不同次检测体积波动大，则结果偏差可能超过 15%。

3. 多样本比较

在比较不同处理组数据时，必须保持体积一致，否则浓度差异将无法反映真实实验差别。

十二、样本体积控制的标准化操作规程（SOP）

仪器准备：检查样品槽是否干净无液滴。
计数板检查：确认腔体无裂痕或残液。
吸样：校准移液枪，吸取 10 µL 样品。
加样：缓慢注入，观察液体填充是否均匀。
观察：检查是否有气泡或局部空区。
检测：加载完成后立即启动分析。
数据记录：每次检测记录操作者与样本编号。

通过标准化流程可显著减少体积波动带来的误差。

十三、影响样本体积稳定性的外部因素

移液枪精度
长期使用的移液器可能存在弹簧老化或刻度偏差，应每季度校准一次。
环境温度与粘度
温度变化影响液体体积与流动性。高温导致体积膨胀，低温则流速减慢。
检测环境应保持在 20–25 ℃。
操作者习惯
不同操作者加样速度与角度不同，也可能造成体积微差。建议培训统一操作标准。
计数板批次差异
不同批次计数板的腔体微小偏差可能造成测量差异。建议使用同批次板完成一组实验。

十四、体积误差的实验后修正

若检测后发现体积误差，可根据样品加载量重新计算修正浓度。

假设实际加载体积为 9.5 µL，系统默认体积为 10 µL，
仪器检测浓度为 1×10⁶ cells/mL，修正值为：

$cells/mLC_{修正} = 1×10⁶ × \frac{10}{9.5} = 1.053×10⁶ \text{ cells/mL}$

这种修正计算可部分弥补加载偏差，但仍建议在实验前严格控制体积以避免后期调整。

十五、常见错误操作案例分析

快速推液导致气泡
结果表现为图像亮斑、识别错误；解决方法是减慢加样速度。
吸头接触腔底
导致液体无法均匀扩散，形成局部高浓度区。应保持吸头与底部间隔约 1 mm。
重复使用计数板未干燥
残留液体改变腔体有效体积，造成浓度偏差。应确保彻底干燥后再用。
混匀不足
细胞沉降导致取样不均，虽然体积正确但检测结果偏差明显。

十六、体积控制在不同实验目的下的应用

实验类型	推荐样本体积	特别说明
常规细胞计数	10 µL	标准体积，保证精度
活性检测	10 µL	染色比例与体积一致
细胞大小分布分析	8–10 µL	可适度减少提高清晰度
高密度悬浮细胞	12 µL（稀释后）	防止堆叠，保持统计范围
微型样本检测	5 µL（特定板）	适用于珍贵样品

十七、实验室标准化体积管理建议

统一操作工具：所有检测使用同型号移液枪与吸头。
建立校准记录：定期记录移液枪实际吸液量。
制定加样规范：明确操作步骤、速度、角度与体积。
样品批次标识：在导出报告中注明体积参数。
结果复核机制：对体积异常的检测结果进行二次验证。

通过这些管理措施，可显著提升整体实验质量与数据一致性。

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