质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、引言

细胞计数与活性分析是细胞培养、药物筛选、基因工程、干细胞研究及生物制药过程控制中最基本的实验环节。传统的显微镜和血球计数板方法依赖人工观察，不仅耗时，而且容易受人为误差影响。
赛默飞（Thermo Fisher Scientific）推出的 Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪 通过高分辨率光学系统、数字成像技术与智能图像分析算法，实现了细胞图像的自动捕获与识别。
该仪器的成像原理是其高精度、高重复性和高通量检测的核心。其结合光学显微镜、数字传感器、成像算法和自动聚焦系统的综合优势，能够在短时间内完成样品成像、细胞识别和统计分析。

二、成像系统的总体架构

Countess 3 的成像系统由以下主要部分组成：

1. 光源照明系统——提供均匀的照明光线；

2. 显微光学系统——放大样品图像并聚焦于成像平面；

3. 图像传感器模块——将光信号转换为数字信号；

4. 成像算法系统——进行图像预处理与细胞识别；

5. 自动聚焦与曝光控制系统——确保成像清晰与光线均匀；

6. 数据分析与输出模块——实现结果可视化与统计计算。

该系统以光学显微技术为基础，以数字成像技术为核心，将生物样品的微观影像转化为可定量的数字化数据。

三、光学成像原理

1. 成像基本概念

在Countess 3中，光学系统通过**透射明场成像方式（Bright-field Imaging）**获取细胞影像。
其原理为：光源发出的白光经准直与扩散后穿透细胞悬液。由于细胞与培养液的折射率不同，光线在通过细胞时会发生散射与衍射，形成亮度差异。通过镜头聚焦后，图像传感器记录这些明暗差异，从而产生高对比度的细胞影像。

在此基础上，软件系统对细胞形态、大小、亮度等特征进行识别与分类，实现自动计数。

2. 光路结构

光路通常包括以下几个关键组件：

• LED光源：提供稳定的白光照明；

• 准直透镜（Collimating Lens）：将发散光束转化为平行光，确保照射均匀；

• 漫射片（Diffuser）：消除热点，使视野内亮度均匀分布；

• 样品腔体：样品放置区，光线穿透后形成图像；

• 物镜组（Objective Lens）：放大样品影像；

• 投影镜（Tube Lens）：将图像传递至传感器；

• 成像传感器：记录图像。

光线经过这些光学元件形成透射式图像，仪器内部的光路对准误差控制在0.05°以内，以确保成像清晰稳定。

四、照明系统与光源特性

1. 光源类型

Countess 3 采用高亮度白光LED作为照明光源。LED光具有以下优势：

• 光强稳定，波动小于±2%；

• 使用寿命长（>20,000小时）；

• 低功耗与低热量，避免对细胞样品造成热损伤；

• 色温恒定，保证成像色调一致。

在荧光版本（Countess 3 FL）中，系统还配备了多通道LED光源，用于激发不同波长的荧光信号（如DAPI、GFP、RFP等）。

2. 均匀照明设计

光源经准直后通过漫射系统形成均匀光斑，照度分布误差不超过±5%。这种均匀照明可避免图像出现亮斑或阴影，提高识别算法的准确性。

3. 照明模式切换

系统可在明场模式与荧光模式之间自由切换。
明场用于常规细胞计数和活死判断；
荧光模式用于检测荧光标记信号，实现多维度分析。

五、显微光学系统

1. 光学放大

Countess 3内置固定光学放大倍率（等效10×物镜），能清晰分辨4–60 μm直径范围内的细胞。
通过精密镜片组合，仪器能在单次采样中同时观测到上万个细胞，既保证了足够的分辨率，又兼顾了较大的视场范围。

2. 成像分辨率

光学系统分辨率约为1.5 μm，足以区分细胞边界、气泡和碎片。
与人工显微镜相比，其图像边缘对比度更高，适合算法识别。

3. 镜头防差校正

镜片采用多层抗反射镀膜，有效减少杂散光；
同时，通过平场校正（Flat Field Correction）修正像差，使中心与边缘图像亮度一致。

六、图像传感器与信号转换

1. 传感器类型

仪器采用高灵敏度CMOS数字成像传感器，具有高分辨率、低噪声、快速响应等特点。
主要参数如下：

• 有效像素：2048 × 1536；

• 像素尺寸：3.45 μm × 3.45 μm；

• 动态范围：12-bit灰度深度；

• 信噪比：>40 dB；

• 帧率：≥60 fps。

2. 光电转换原理

传感器将入射光信号转换为电荷信号，经模数转换器（ADC）处理后形成数字图像。系统在图像采集过程中进行实时降噪与平场校正，确保每个像素点的灰度值准确。

3. 图像质量控制

仪器具有自动曝光功能，通过测量图像亮度实时调节曝光时间与增益，使图像亮度保持在最佳范围，避免过暗或过曝现象。

七、自动聚焦与成像控制原理

1. 聚焦机制

Countess 3采用**自动聚焦（Auto Focus）**技术。系统通过控制镜头沿Z轴移动，连续采集多个焦平面图像，并计算每张图像的清晰度指标（如Laplacian方差）。当清晰度达到峰值时，系统自动锁定该焦点位置。

2. 聚焦精度

• 调焦步进精度：1 μm；

• 重复聚焦偏差：<2 μm；

• 聚焦时间：<3 秒。

3. 曝光控制

自动曝光系统根据光强分布自动选择最佳曝光时间，并可手动微调。曝光时间范围为0.1–1000 ms，适应不同亮度样品。

八、图像预处理与信号优化

图像采集后，系统会执行多步图像预处理，以提高识别准确性：

1. 去噪处理：利用中值滤波与高通滤波消除背景噪声；

2. 对比度增强：通过直方图均衡化算法增强细胞边缘；

3. 背景校正：扣除非均匀照明造成的亮度梯度；

4. 灰度阈值分割：区分细胞区域与背景区域；

5. 形态学操作：去除碎片信号，平滑细胞边缘。

经过这些处理，最终形成清晰、结构化的细胞影像，为后续算法识别提供高质量输入。

九、成像算法与细胞识别

1. 边缘检测

系统采用基于Canny和Sobel算子的边缘检测算法，通过灰度梯度计算识别细胞边界。

2. 区域分割

对于聚团细胞，系统使用分水岭算法（Watershed Transform）将连接的细胞区域分割为独立对象，防止“过计数”或“漏计数”。

3. 特征提取

算法提取细胞的关键形态参数：

• 面积（Area）；

• 周长（Perimeter）；

• 圆度（Circularity）；

• 平均亮度（Mean Intensity）；

• 灰度分布特征。

这些参数用于区分细胞与杂质、死细胞与活细胞。

4. 智能分类

内置AI识别模型根据大量训练数据建立判定标准，自动识别不同类型细胞（如圆形、椭圆形、不规则形）。

十、活死细胞成像识别原理

1. 染料透膜分析

活死细胞区分基于染料透膜性差异。最常用的是台盼蓝排除法：

• 活细胞膜完整，染料无法进入，图像中呈透明；

• 死细胞膜破裂，染料进入后呈深色区域。

2. 灰度判定阈值

系统依据像素灰度差异设置自动阈值，将低亮度区域判定为死细胞，高亮度区域为活细胞。

3. 图像叠加

对于荧光模式，系统叠加明场与荧光图像，通过通道比对可同时显示活细胞与死细胞分布。

十一、成像分辨率与信号校准

1. 分辨率测试

使用10 μm标准微球作为光学参考物，系统自动校验成像比例与像素密度。
实际测试中，成像比例误差小于2%，说明光学与传感器系统高度匹配。

2. 信号校准

每次启动仪器时，系统会自动检测光源亮度与镜头焦距状态，通过软件补偿维持一致的成像条件。

3. 图像均匀性

成像区域的亮度均匀性控制在±5%以内，确保分析区域间结果可比。

十二、数据输出与可视化

1. 图像显示

7英寸高清触控屏显示成像结果，可放大、缩小或对比不同样品。
系统提供三种视图模式：

• 明场图像；

• 荧光通道图像；

• 叠加图像。

2. 数据统计

软件自动计算以下结果：

• 总细胞数；

• 活细胞数；

• 死细胞数；

• 活性比例；

• 平均直径与体积分布。

3. 数据导出

结果可导出为CSV、PDF、TIFF等格式，用于后续统计分析或报告生成。

十三、影响成像质量的因素与优化方法

十四、成像原理的技术优势

1. 高分辨率与高对比度：清晰识别微小细胞边界；

2. 自动聚焦与曝光：避免人工误差，保证重复性；

3. 大视野成像：一次捕获上万个细胞，提高统计可靠性；

4. 智能算法识别：精准区分细胞与杂质；

5. 多模式兼容：支持明场与荧光成像；

6. 实时分析输出：检测与数据生成一体化。