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一、概述

赛默飞细胞计数仪 Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter 是一款基于光学显微成像与智能算法的全自动细胞计数设备。其核心检测系统包含两种主要模式：

• 明场模式（Brightfield Mode）

• 染色模式（Trypan Blue Stained Mode）

其中，明场模式 是最常用的检测方式之一，主要用于未染色样品的总细胞计数、细胞形态观察及大小分布分析。
在该模式下，仪器依靠可调光源照射与高分辨率成像，捕捉细胞在自然状态下的图像信息，不需要额外染料即可实现高对比度的识别。

明场模式具有操作简便、检测速度快、无染料干扰等优势，尤其适用于对细胞状态要求较高、或不希望引入化学成分的实验场景。

二、明场模式的成像原理

1. 光学路径结构

Countess 3 的明场系统由 LED 白光源、准直透镜、样品载板、显微镜物镜、成像镜组与 CMOS 感光组件组成。
检测时，光源自下而上穿过样品，细胞因折光率高于溶液而产生光散射与衰减。

经过样品的光线被物镜收集后投射至成像传感器，系统生成灰度图像。
细胞的折射差异使其在背景中呈现出轮廓清晰、中心略暗的阴影形态。

2. 图像形成机制

明场成像是一种“透射光”技术。
其基本物理特性如下：

• 透明样品对光线吸收较少；

• 不同密度与厚度造成光强变化；

• 系统通过灰度变化还原细胞形态。

算法会根据光强分布判断细胞边缘，进而计算数量与直径。

3. 无染色成像优势

与染色模式相比，明场模式避免了染料对细胞膜和代谢的潜在影响，使检测结果更接近细胞自然状态。
尤其在活细胞实验、短时间监测或需要后续培养的样品中，明场模式可最大限度保留样品活性。

三、明场模式的检测范围

Countess 3 明场模式适用于大多数悬浮或经胰酶处理后的贴壁细胞。

1. 推荐样品浓度

1 × 10⁴ – 1 × 10⁷ cells/mL

若浓度超过此范围，需稀释或浓缩以获得最佳图像清晰度。

2. 细胞直径检测范围

4 µm – 60 µm

系统算法可自动识别不同直径细胞，适用于从淋巴细胞到肿瘤细胞的多类型样本。

3. 样品类型

• 贴壁细胞消化后悬液（HEK293、CHO、HeLa 等）

• 原代免疫细胞

• 悬浮细胞系（Jurkat、HL-60 等）

• 酵母或真菌孢子（需调整参数）

四、明场模式的核心算法

明场图像经采集后，Countess 3 软件通过多步骤分析完成自动计数：

1. 背景去除

系统使用动态滤波算法消除光照不均与背景噪声，使细胞轮廓更清晰。

2. 边缘识别

基于灰度梯度变化确定细胞边界。活体细胞通常在边缘处光强下降明显，形成高对比边缘。

3. 对象筛选

系统根据面积、圆度、灰度值区分细胞与杂质。非细胞颗粒会被自动排除。

4. 重叠细胞分割

利用形态学算法将重叠细胞分离为独立个体。该功能在高密度样品中尤为重要。

5. 数据统计

完成识别后，系统自动生成总细胞数量、平均直径及浓度值。

五、明场检测操作流程

步骤 1：样品制备

• 确保细胞悬液均匀分散，无明显聚集；

• 若样品浓度过高，使用 PBS 稀释；

• 加载体积为 10 µL。

步骤 2：加载样品

• 将样品缓慢注入计数板腔体；

• 检查无气泡与空腔；

• 插入仪器检测槽内。

步骤 3：启动明场模式

• 开机进入主界面，选择 Brightfield 模式；

• 软件自动优化光源亮度与焦距；

• 若需要，可手动微调对焦。

步骤 4：检测与结果显示

• 检测过程约需 10–20 秒；

• 系统自动输出细胞总数、浓度与平均直径；

• 结果以图像与数据表双重形式显示。

步骤 5：保存与导出

可选择导出 CSV、JPEG 或 PDF 格式文件，包含检测图像与数据统计。

六、图像质量与调节技巧

1. 光源亮度

适度光照可增强细胞与背景的对比度。
过亮会导致细胞轮廓模糊；过暗则噪声增多。
建议亮度调节在 50–70% 区间。

2. 焦距控制

自动对焦功能可在 2 秒内完成焦距调整。
若出现局部模糊，可手动微调焦距旋钮，使细胞边缘最为锐利。

3. 样品厚度

样品层应均匀，避免液面倾斜。厚度不均会造成边缘成像差异。

4. 环境影响

保持样品仓干净，避免灰尘、指纹或光线干扰。

七、明场模式下的数据输出内容

检测完成后，系统自动生成如下结果：

1. Total Cell Count（总细胞数）：视野中所有细胞数量。

2. Concentration（细胞浓度）：根据采样体积换算的单位体积浓度。

3. Mean Diameter（平均直径）：反映细胞大小均一性。

4. Diameter Distribution（直径分布图）：显示细胞大小的整体分布情况。

5. Image Display（图像显示）：带有识别标记的图像，供用户复核。

所有结果均实时生成，误差率低于 ±5%。

八、明场模式的优势分析

1. 无染色操作

省去染料制备步骤，节约时间，避免化学干扰。

2. 保持细胞活性

检测过程中不破坏细胞结构，可直接回收样品用于后续实验。

3. 检测速度快

单次检测仅需几十秒，适合批量样品快速筛查。

4. 数据客观

算法自动识别，减少人为主观判断误差。

5. 图像可视化

用户可直观观察细胞状态，包括形态、聚集程度与背景杂质。

九、明场模式与染色模式的对比

明场模式通常用于细胞计数与常规培养质量控制，而染色模式更侧重活性分析。

十、常见问题与排查

通过规范化操作，可大幅减少上述问题出现的概率。

十一、明场模式的应用场景

1. 细胞培养密度评估

通过快速计数判断细胞密度，确定传代或分装时机。

2. 生长曲线绘制

每日检测样品浓度，绘制细胞增殖曲线，用于培养特性研究。

3. 实验前计数

用于药物处理、转染、感染实验前，计算准确接种量。

4. 细胞形态监测

观察细胞大小、圆度、分布，判断培养状态是否正常。

5. 悬浮细胞实验

如免疫细胞、血液细胞等，可直接检测浓度与分布，无需染色。

十二、提高明场检测精度的技巧

1. 样品均匀性
   检测前轻轻混匀样品，防止细胞沉降。

2. 合适浓度控制
   建议在 10⁵–10⁶ cells/mL 之间。

3. 标准化加载体积
   严格控制 10 µL 样品体积，保持层厚一致。

4. 定期校准光源
   使用标准样品验证光照均匀度，确保图像稳定。

5. 建立检测模板
   可在软件中保存参数模板，保证不同操作者结果一致。

十三、数据分析与导出

检测结果可直接导出为：

• CSV 文件：包含数值数据，可进行统计分析；

• JPEG 图像：保存成像结果；

• PDF 报告：用于正式实验记录。

用户可在报告中查看：

• 总细胞浓度与统计误差；

• 平均直径与分布图；

• 检测参数（光源亮度、曝光时间等）。

这些数据支持实验记录归档与质量审查。

十四、明场模式的优势应用实例

1. 细胞传代计划制定
   通过明场计数获得生长速率，决定最佳传代时间。

2. 生物反应器监测
   实时检测悬浮细胞密度，指导培养基补充与收获时机。

3. 疫苗生产质量控制
   明场模式可快速检测批次样品密度，保障一致性。

4. 干细胞研究
   保留细胞活性，观察形态变化，评估分化状态。

十五、常见误差来源与控制

十六、明场模式的维护与保养

1. 每次检测结束后擦拭计数板，防止样品残留；

2. 定期清洁光学窗口和镜头；

3. 避免液体渗入样品仓；

4. 每三个月校准焦距系统；

5. 定期更新软件算法，以获取最新图像识别优化功能。

十七、明场模式的未来发展方向

随着图像识别与人工智能算法的进步，Countess 系列的明场系统将进一步增强在以下方面的性能：

• 自动学习算法：可根据不同细胞类型自动优化识别参数；

• 多视野拼接：提升样品覆盖范围，增强统计精度；

• 三维成像扩展：通过焦平面叠加实现立体结构识别；

• 实时动态监测：实现细胞生长实时观察。

这些创新将使明场模式不仅用于计数，还可成为细胞表型分析的重要工具。