质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、概述

在细胞培养与生命科学实验中，死细胞识别（Dead Cell Identification） 是评估细胞群体健康与实验质量的重要环节。
赛默飞细胞计数仪 Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter 通过明场成像结合台盼蓝（Trypan Blue）染色法，实现了快速、自动化的死细胞识别与比例分析。
仪器内置智能图像算法，可在短时间内区分活细胞与死亡细胞，为研究人员提供可靠的活性数据。

死细胞识别不仅用于细胞培养质量控制，也广泛应用于药物筛选、细胞毒性分析、冻存复苏评估及基因编辑实验中。Countess 3 自动化的识别方式，相较人工显微镜计数，大幅减少了主观误差与操作时间，为实验室提供了高效、客观的数据支持。

二、死细胞识别的基本原理

1. 细胞膜完整性判断

死细胞识别的核心依据是细胞膜通透性变化。
在正常生理状态下，细胞膜具有良好的选择性通透性，可阻止染料分子进入细胞内部；而当细胞死亡或膜受损时，染料可自由进入胞质，与细胞成分结合形成可见的染色信号。

Countess 3 使用台盼蓝染料（Trypan Blue）进行区分：

• 活细胞：膜完整，不透染料，呈透明无色；

• 死细胞：膜破裂，染料进入后结合蛋白质，呈深蓝色。

2. 光学识别原理

仪器通过明场显微成像获取样品图像。
图像中的亮度差异反映了细胞对光线的吸收或散射程度。死细胞吸收更多光线，显得颜色较深，算法可据此自动识别。

系统利用高分辨率成像模块检测每个细胞的亮度分布、边缘清晰度与内部灰度值，从而判定其生存状态。

三、检测算法与软件识别机制

1. 图像分割

Countess 3 的算法首先对采集到的样品图像进行背景去除与灰度增强，随后将每个细胞区域分割出来。

2. 灰度阈值判断

系统根据台盼蓝吸收特征设定灰度阈值。
当像素平均灰度低于某一临界值时，系统判定该细胞为“死细胞”；高于阈值者则为“活细胞”。

3. 边界优化与假阳性排除

算法进一步对细胞边缘进行锐化与滤波处理，以排除细胞碎片、杂质或气泡的干扰。
通过计算细胞形态参数（圆度、面积、亮度梯度等），软件能够准确识别真实细胞并剔除噪声信号。

4. 数据输出

检测完成后，系统自动计算：

• 死细胞数；

• 活细胞数；

• 总细胞数；

• 活性百分比。

结果以数值表和直观图像标记形式同时显示。死细胞通常以红色或深蓝色圈出，活细胞以浅蓝或透明边界表示。

四、死细胞识别的样品准备要求

1. 染色步骤

死细胞识别依赖于台盼蓝染色，标准操作如下：

1. 吸取 10 µL 细胞悬液；

2. 与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液 混合，轻轻吹打均匀；

3. 静置 2 分钟，让染料与细胞充分反应；

4. 立即取样进行检测。

2. 染色时间控制

染色时间是影响结果准确性的关键参数。

• 时间过短：死细胞未完全着色，识别不全；

• 时间过长：活细胞膜逐渐失稳，出现假阳性。

建议染色反应时间保持在 1–3 分钟。

3. 染料比例

台盼蓝与样品体积比例为 1:1 最为适宜。
过量染料会导致背景过暗，影响算法识别；比例不足会降低染色效果。

4. 样品浓度要求

样品浓度应控制在 1×10⁵–1×10⁶ cells/mL，确保细胞在视野内分布均匀。过高浓度会导致细胞堆叠、识别困难。

五、光学与算法参数设置

在死细胞识别模式下，Countess 3 的软件自动优化以下参数：

1. 光源亮度：系统会自动调节至适中水平，避免死细胞过度吸光造成图像饱和。

2. 曝光时间：控制在 10–20 毫秒之间，保证细胞边界清晰。

3. 识别灵敏度：根据细胞类型可在低、中、高三档选择。一般建议使用中等灵敏度。

4. 细胞直径范围：可手动设定，避免误判小碎片为细胞。

这些参数可在“检测设置”界面中调整，以适应不同实验样品。

六、结果显示与数据分析

检测完成后，系统自动生成死细胞识别结果，包括：

1. 总细胞浓度：活细胞与死细胞总和。

2. 死细胞浓度：单位体积中被识别为死亡的细胞数量。

3. 活性百分比：

   Viability (%)=Live CellsTotal Cells×100\text{Viability (\%)} = \frac{\text{Live Cells}}{\text{Total Cells}} × 100Viability (%)=Total CellsLive Cells×100

4. 图像标记结果：

• 活细胞：透明边界或浅色圆圈；

• 死细胞：深色或红色标识；

• 细胞碎片：被自动排除。

5. 分布图表：系统会绘制直方图显示活、死细胞的比例差异，便于快速评估样品状态。

七、影响死细胞识别准确度的因素

1. 染色质量

• 染料过期或浓度错误会导致染色不均。

• 混合不充分会产生局部染料浓度差异。

2. 样品浓度

• 过浓样品导致重叠遮挡；

• 过稀样品统计误差大。

3. 光学清晰度

• 计数板不洁净或有气泡，会形成假信号。

• 样品层厚度不均，光线穿透不一致。

4. 算法参数设置

• 灵敏度过低可能漏检；

• 灵敏度过高易将杂质识别为死细胞。

5. 样品保存时间

染色后放置时间超过 10 分钟，活细胞膜可能自然破裂，导致活性数据偏低。

八、常见问题与处理方法

九、不同实验场景下的死细胞识别应用

1. 细胞培养质量监控

在常规传代或培养过程中，活性监测有助于判断细胞生长状态。
当活性低于 80% 时，应考虑更换培养基或调整培养条件。

2. 药物毒性实验

药物处理后死细胞比例升高，反映化合物的细胞毒性强度。
通过死细胞数据可计算 IC₅₀ 值，为药物筛选提供依据。

3. 冻存与复苏评估

冻存细胞复苏后应立即检测活性，评估冻存过程中的损伤程度。死细胞比例超过 30% 表示复苏条件不理想。

4. 转染与感染实验

转染效率高但细胞死亡率上升，可能说明试剂毒性或基因过表达引发细胞凋亡。Countess 3 的活性数据可为转染条件优化提供参考。

5. 干细胞与免疫细胞研究

这类细胞对环境变化敏感，实时监测活死比有助于维持培养体系稳定性。

十、算法识别优化技巧

1. 设定合适的直径范围
   若细胞大小差异大，可扩大检测区间；若背景噪声多，应适当缩小范围。

2. 调整灵敏度
   对透明细胞可适度提高识别灵敏度；对染色深的样品可降低。

3. 启用背景修正
   自动平衡光照不均，减少背景噪点干扰。

4. 使用多视野检测
   Countess 3 支持多视野平均，提高统计可靠性。

5. 保存并复核图像
   通过导出图像对识别结果进行二次人工验证，确保算法准确性。

十一、死细胞识别与活性计算误差控制

1. 重复检测

对同一样品进行 2–3 次检测取平均值，可降低偶然误差。

2. 对照样品设置

同时检测未经染色的样品，确认背景亮度与细胞形态。

3. 定期校准

使用标准细胞悬液定期验证算法准确度，确保识别一致性。

4. 标准化操作

制定统一的染色与加载 SOP，减少人为差异。

十二、死细胞识别的高级分析扩展

1. 细胞直径与活性关系分析
   仪器可输出细胞大小分布图，通过观察活、死细胞在直径上的差异，分析细胞损伤机制。

2. 活性变化趋势图
   对多次检测结果进行汇总，绘制活性随时间变化的曲线，用于长期培养监控。

3. 与外部统计软件联用
   导出 CSV 数据后，可在 Excel 或专业统计软件中进行相关性分析与回归建模。

4. 多样本批量分析
   Countess 3 支持样品批量检测与自动报告生成，适合高通量实验需求。

十三、死细胞识别与实验数据可靠性

死细胞识别的精确性直接影响活性数据的可靠性。
例如，在药物筛选实验中，若死细胞识别误差 ±5%，可能导致结果显著偏差。
因此，仪器操作人员必须定期培训，熟悉染色规范与识别机制，确保每次检测在标准化条件下完成。

高质量的死细胞识别不仅能提升单次实验的数据可信度，还能使长期监测结果具备统计可比性。

十四、常用质量控制标准

这些标准有助于实验室建立死细胞识别的质量体系。

十五、数据导出与报告

检测完成后，用户可将结果导出为 CSV、JPEG 或 PDF 格式。
报告中包含：

• 活细胞与死细胞数量；

• 活性百分比；

• 检测时间与样品编号；

• 标记图像与直方图。

这些数据可直接用于科研记录或质量审核，确保死细胞识别结果的可追溯性。