赛默飞细胞计数仪Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter校准方法
质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司
一、引言
Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪是一款集光学成像、AI图像识别与数据分析于一体的智能化细胞检测设备，其计数精度与稳定性高度依赖于系统的正确校准。
校准是确保仪器性能、数据准确性与重复性的重要环节。通过定期执行光学、算法、染色和机械部件的校准，可以有效消除由于环境变化、镜头偏移、光源衰减或软件参数漂移造成的误差。
本章节将系统介绍Countess 3的校准原理、步骤、频率及质量控制标准，帮助用户建立完整的校准体系，保障仪器长期稳定运行。
二、校准目的与原理
1. 校准目的
校准的核心目标在于确保仪器在规定条件下输出的检测结果具有可重复性与可溯源性，具体包括：
维持细胞计数的准确度；
保证光学成像清晰与聚焦准确；
确认算法识别阈值与实际细胞尺寸的一致性；
确保染色区分的有效性与亮度均匀性；
维护仪器在不同环境下的性能稳定。
2. 校准原理
Countess 3的校准基于光学标定、算法匹配与信号强度补偿原理：
光学系统校准通过标准微球检测光路与成像比例；
图像算法校准通过人工计数比对调整识别模型；
荧光通道校准依据荧光强度标准物校正激发与检测平衡；
数据系统校准则确保像素与物理尺寸转换系数的准确性。
三、校准分类与周期
Countess 3的校准工作可分为以下五类：
| 校准类型 | 主要目的 | 推荐周期 |
|---|---|---|
| 光学校准 | 确保图像清晰与尺寸比例准确 | 每6个月一次 |
| 聚焦系统校准 | 检验自动聚焦精度 | 每3个月一次 |
| 算法校准 | 修正细胞识别参数与计数算法 | 每半年或软件更新后 |
| 荧光通道校准（如适用） | 校正多通道光强一致性 | 每月一次 |
| 系统验证校准 | 进行整体性能检测与报告存档 | 每年一次 |
校准周期应根据实验频率和环境条件适当调整。如仪器长时间搬动或使用环境变化（温度、湿度等），需立即重新校准。
四、光学校准方法
1. 校准原理
光学校准是整个系统校准的基础。其原理是利用直径已知的标准微球（通常为10 μm聚苯乙烯或乳胶微球）建立光学图像尺寸与实际物理尺寸之间的比例关系，从而修正镜头放大倍率、像素间距和成像畸变。
2. 校准材料
赛默飞认证标准校准微球（直径10.0 ± 0.1 μm）；
无菌PBS溶液（稀释微球悬液用）；
一次性计数芯片或清洁载玻片；
无尘擦拭纸与70%乙醇。
3. 校准步骤
样品制备：将标准微球按1:100稀释于PBS中，轻轻混匀；
上样操作：取10 μL稀释液注入计数芯片或载片；
插入仪器：将载片插入样品槽，进入“校准模式”；
自动聚焦：点击“Auto Focus”按钮，系统自动寻找最佳焦平面；
图像采集：点击“Capture”获取微球图像；
系统计算：软件自动测量微球平均直径并与标准值比较；
误差修正：若平均误差>5%，系统会提示进行比例系数调整；
结果保存：确认校准成功后保存校准文件，记录日期与操作者姓名。
4. 注意事项
校准时应避免气泡进入样品腔；
微球悬液需充分混匀，防止沉降；
校准结果应保存至系统日志，以便追溯。
五、自动聚焦系统校准
1. 校准目的
自动聚焦系统校准用于验证镜头移动与焦平面的对应精度，确保图像清晰度最大化。长期使用后，由于机械组件的轻微磨损或震动，焦距校正机制可能发生偏移，因此需要定期检测。
2. 校准原理
系统通过计算不同焦距下图像清晰度的变化曲线，确定最佳聚焦点。若焦点偏移，校准程序会调整驱动步进电机的位移步长与反馈系数。
3. 校准过程
选择仪器主菜单的“焦距校准（Focus Calibration）”功能；
插入标准校准片（带固定颗粒的光学载片）；
系统自动扫描不同焦距位置并计算图像清晰度指标；
通过算法确定最优焦点并更新系统参数；
校准结果自动保存并生成日志报告。
4. 校准判定标准
若连续三次焦距校准的清晰度曲线偏差小于±2%，则聚焦系统合格；若偏差超过5%，需重新执行机械检查或联系客服维修。
六、算法与计数精度校准
1. 校准目的
算法校准用于验证仪器自动识别细胞的准确度。通过与人工计数结果对比，调整算法的识别阈值、边界分割及聚团判定参数。
2. 校准样品
均匀分散的细胞悬液样本（如HeLa、CHO或293T细胞）；
0.4%台盼蓝染液；
标准计数板（如Neubauer血球计数板）。
3. 校准步骤
人工计数：使用血球计数板手工计数三次，记录平均值；
仪器检测：用相同样品在Countess 3上进行自动计数；
结果比较：计算仪器结果与人工计数的偏差率；
参数调整：若偏差>10%，进入“算法设置”，调整细胞识别阈值、圆度限制和细胞大小参数；
重复检测：重新检测样品，直至偏差控制在±5%以内；
保存算法模板：为特定细胞系创建专属分析模板，便于后续快速调用。
4. 注意事项
样品必须充分混匀，防止细胞沉降；
细胞聚团时应酶消化分散后再进行校准；
每次软件更新后应重新执行算法校准。
七、荧光通道校准（适用于Countess 3 FL版本）
1. 校准原理
荧光通道的校准主要用于平衡各通道的激发光强与探测灵敏度。由于LED光源衰减和滤光片老化，荧光信号可能出现漂移。通过标准荧光微球或校准片进行强度校正，可保证多通道数据可比性。
2. 校准材料
GFP、RFP及DAPI标准荧光微球；
荧光参考片；
无尘擦拭布与异丙醇。
3. 校准步骤
选择“Fluorescence Calibration”功能；
插入对应通道的标准微球；
系统自动捕获荧光信号并记录峰值强度；
比较各通道信号与标准曲线的偏差；
软件自动调整曝光时间与增益系数；
输出荧光均衡报告并保存。
4. 校准结果判断
各通道信号偏差小于±5%视为合格。若偏差过大，应检查滤光片清洁度或光源老化情况。
八、机械系统与图像稳定性验证
1. 校准目的
机械系统的稳定性直接影响成像一致性。该部分主要验证载片移动精度、图像稳定性及热漂移补偿。
2. 校准过程
进入“Mechanical Calibration”模式；
仪器自动移动载片平台，检测重复定位误差；
系统分析图像偏移量并修正机械位移参数；
若偏移量>2 μm，系统提示维护；
校准结果自动生成报告文件。
3. 稳定性测试
可在仪器运行1小时后重复采集相同样品图像，对比细胞位置偏差，若偏差<2像素，说明稳定性良好。
九、校准结果记录与数据管理
1. 校准记录格式
每次校准完成后，系统会生成报告，内容包括：
校准日期与时间；
操作人员；
校准类型与样品信息；
调整参数与修正系数；
校准结果及合格判定；
自动生成的系统签名与版本号。
2. 数据备份与存档
校准文件保存在系统内部数据库；
可通过USB或网络导出至实验室服务器；
建议每次校准报告保存至少一年以供追溯。
十、校准质量控制（QC）程序
为保证仪器持续处于最佳状态，应建立定期质量控制体系：
| 项目 | QC频率 | 控制样品 | 合格标准 |
|---|---|---|---|
| 光学校准 | 每6个月 | 10 μm标准微球 | 误差<5% |
| 算法校准 | 每半年 | 标准细胞样品 | 误差<10% |
| 荧光校准 | 每月 | 荧光微球 | 偏差<5% |
| 聚焦校准 | 每3个月 | 校准片 | 清晰度偏差<2% |
| 系统检测 | 每年 | 综合验证样品 | 各项指标合格 |
十一、常见校准问题与解决方案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 校准失败提示 | 样品浓度过高或图像模糊 | 稀释样品并重新聚焦 |
| 荧光信号过弱 | 光源衰减或滤光片污染 | 清洁光学元件或更换光源 |
| 校准误差大 | 微球沉降或不均匀 | 使用新鲜悬液并充分混匀 |
| 自动聚焦异常 | 电机位置偏移 | 执行机械重置 |
| 算法偏差 | 软件更新导致参数变化 | 重新加载算法模板并校准 |
十二、校准安全与注意事项
校准操作应由经过培训的实验人员执行；
使用标准微球时避免吸入或直接接触；
校准样品用后应按实验室生物安全规范处理；
校准过程中禁止强光直视荧光激发源；
不得随意修改系统参数文件，以防算法失效。
十三、校准后的验证实验
校准完成后，应进行验证测试以确认校准有效性：
选取已知浓度的细胞悬液，分别人工计数与仪器检测；
比较结果误差应在±5%以内；
测试不同批次样品，确认系统重复性；
若验证不通过，需重新执行相关校准项目。
十四、长期维护与再校准策略
若仪器连续使用超过1000次或6个月，应执行全系统再校准；
更换LED光源、摄像模组或镜头后，必须重新光学校准；
在运输或环境改变后（例如实验室搬迁），应重新执行机械与算法校准；
建议建立“年度校准计划表”，确保校准周期性与文件归档。
