质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司

一、引言

自动化细胞计数技术是现代细胞生物学研究的重要支撑手段之一。传统的手工血球计数板方法虽然成本低廉，但受人为因素影响较大，计数误差高、效率低且重复性差。为此，赛默飞公司推出了Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪，它将高分辨率光学成像、图像识别算法与人工智能分析系统相结合，实现了对细胞数量、活性及形态参数的快速定量分析。
该仪器的检测原理基于明场光学成像与图像数字化识别算法，并辅以染料透膜原理进行活死细胞区分。通过对细胞影像的自动采集与分析，Countess 3可在数秒内提供准确的细胞计数结果与活性评估，从而显著提升实验通量与数据可靠性。

二、检测原理概述

Invitrogen Countess 3的检测原理可概括为以下几个核心环节：

1. 光学成像：利用高分辨率显微镜系统对细胞样本进行明场或荧光成像。

2. 数字图像获取：通过内置CMOS传感器将光学图像转化为数字信号。

3. 图像预处理：包括背景校正、噪声过滤、对比度增强等操作，以提高细胞识别准确性。

4. 目标识别与分割：基于AI算法识别细胞边缘并分离重叠细胞。

5. 参数计算与统计：对识别到的单个细胞进行计数、面积、直径及活性状态分析。

6. 结果输出：系统自动生成总细胞数、活细胞数、死细胞数及活性百分比等数据。

整个检测过程实现了从样品上样到数据输出的全自动化处理，最大限度地减少了人为操作误差。

三、光学检测原理

1. 明场成像原理

Countess 3采用经典的明场显微成像系统。白光LED光源照射样品后，光线穿过细胞悬液。由于细胞与周围溶液在折射率上存在差异，细胞会对入射光产生散射与吸收，形成明暗对比图像。
系统通过高分辨率10×物镜收集透射光，并投射到CMOS成像芯片上。细胞在图像中呈现为明暗分明的圆形或椭圆形轮廓。仪器利用这些亮度差异识别单个细胞的边界，实现自动计数。

2. 荧光成像原理

对于带有荧光标记的细胞样本，仪器可切换至荧光模式。
在该模式下，内置LED光源发出特定波长的激发光（如蓝光、绿光或紫外光），激发样品中的荧光染料。细胞发出的荧光经滤光片筛选后进入检测通道，被CMOS传感器捕获。
系统可同时采集多通道图像，从而识别不同荧光信号的细胞类型。例如：

• GFP信号代表转染阳性细胞；

• DAPI信号标示细胞核；

• RFP信号可用于报告基因或标记蛋白的表达。

这种多通道荧光成像技术使仪器不仅限于细胞计数，还能实现细胞功能状态的定量分析。

四、活死细胞检测原理

1. 染料透膜原理

活细胞与死细胞的区分基于细胞膜完整性差异。Countess 3常用的检测方法是台盼蓝排除法（Trypan Blue Exclusion）。

• 原理：台盼蓝是一种亲水性染料，无法穿透完整细胞膜。

• 活细胞膜完整，染料无法进入，因此在显微图像中呈透明状态；

• 死细胞膜破裂，染料进入细胞质后使其呈蓝色。
  仪器通过明暗灰度差异自动识别染色状态，从而计算出活细胞与死细胞数量。

2. 荧光染料辅助分析

对于荧光版本的Countess 3，可使用不同染料进行更精准的活性检测：

• SYTO 9 / PI法：SYTO 9可穿透所有细胞染色核酸，而碘化丙啶（PI）仅能进入死细胞。通过绿红荧光比值判断活性；

• Calcein-AM / EthD-1法：Calcein-AM在活细胞内被酯酶转化为绿色荧光，而EthD-1仅染死细胞核；

• Annexin V-FITC / PI双染法：可用于检测细胞凋亡早期与晚期阶段。

Countess 3通过多通道荧光图像分析算法，实现不同染料信号的自动区分与计数，从而得出更加精确的活性百分比。

五、图像采集与预处理原理

1. 数字成像过程

细胞图像由CMOS图像传感器采集后转化为数字信号。每个像素点对应光强值（灰度级），形成二维矩阵。仪器软件将这些信号进行灰度分布计算，用于后续细胞边缘识别。

2. 图像增强与去噪

由于样品杂质、气泡或背景光照不均匀，原始图像可能含有噪声。系统在分析前会进行预处理：

• 背景扣除：去除均匀背景亮度；

• 高通滤波：强化细胞边缘对比度；

• 形态学运算：去除小颗粒杂点与非细胞信号；

• 自适应阈值：根据整体亮度动态确定分割阈值。

3. 聚焦优化

Countess 3具有自动聚焦系统。算法通过对连续图像的清晰度函数（如拉普拉斯方差）进行计算，选择清晰度最大的位置作为最佳焦平面，保证成像锐利、边缘清晰。

六、细胞识别与分割算法

1. 识别机制

仪器采用多步图像处理算法与深度学习模型结合的方式实现细胞识别：

1. 边缘检测：基于Sobel或Canny算子提取细胞边界；

2. 区域生长：通过像素聚类形成封闭细胞轮廓；

3. 形态学分析：判断细胞圆度、面积、边缘平滑度等参数，以剔除杂质与碎片；

4. AI分类器：深度神经网络模型识别细胞聚集与重叠情况，进行自动分离。

2. 重叠细胞处理

传统算法在面对聚团细胞时容易误判为单个细胞。Countess 3通过形态学重建与分水岭算法（Watershed Transform）进行细胞分割。该算法基于细胞灰度强度的局部极值点，将聚集体划分为多个独立细胞区域，确保计数准确。

3. 统计与校正

系统会自动排除以下信号：

• 小于4 μm的颗粒（判定为杂质）；

• 圆度偏差过大的异常对象；

• 图像边缘不完整的细胞。
  通过这些过滤机制，确保最终结果的可信度。

七、参数计算原理

在识别出单个细胞后，系统对每个目标执行以下计算：

• 直径（D）：根据像素数量与标定倍率计算细胞平均尺寸；

• 面积（A）：像素累计面积转换为实际单位；

• 体积（V）：假设细胞为球体，利用 V=43π(D/2)3V = \frac{4}{3}\pi (D/2)^3V=34π(D/2)3 计算；

• 浓度（C）：根据采样体积与细胞数推算每毫升浓度；

• 活性（V%）：活细胞数/总细胞数×100%；

• 分布曲线：统计不同直径区间内的细胞数量，生成直方图。

这些计算过程在软件后台自动完成，用户可直接获得统计图表与数值结果。

八、荧光信号识别原理

1. 光谱分离技术

荧光检测模式下，仪器采用多带滤光系统，通过不同滤光片组分离激发光与发射光，防止串色干扰。每个荧光通道均配有独立光源与检测路径，保证信号纯度。

2. 信号强度分析

系统对每个像素的荧光强度进行量化，设定阈值后判断细胞是否为阳性。通过多通道叠加，可同时识别多种标记物表达。
例如：

• 在绿色通道中检测转染细胞比例；

• 在红色通道中监测细胞死亡标志信号。

3. 背景校正与自动增益

Countess 3配备自动增益（Auto Gain）与背景扣除算法，能够根据样品信号强度调整曝光时间与放大系数，确保荧光检测的线性响应范围。

九、误差控制与精度保障原理

1. 光学校准系统：仪器在出厂时通过标准颗粒（10 μm微球）进行光学路径标定，保证像素尺寸与实际距离匹配。

2. 算法自学习功能：系统能根据不同细胞类型调整识别参数，例如圆度、亮度阈值与聚团判断系数。

3. 重复检测校正：同一样品可在不同位置重复成像，系统计算平均值以降低局部误差。

4. 边界效应修正：自动排除图像边缘未完整显示的细胞。

5. 温度补偿：内置温度传感器可修正电子噪声对图像信号的影响，确保长期稳定运行。

十、数据输出与统计逻辑

检测完成后，Countess 3系统自动生成以下数据报告：

• 数值结果：活细胞数、死细胞数、总数、活性比例；

• 图形结果：细胞大小分布直方图、活性散点图；

• 图像结果：原始与分析叠加图像，细胞边界标记清晰；

• 数据格式：CSV与PDF导出，便于统计与记录；

• 多样本比较：支持多次检测结果叠加分析，用于实验重复性验证。

系统的数据统计基于细胞识别总数及采样体积，自动计算浓度值并附带误差范围，保证科研数据的科学性与溯源性。

十一、与传统方法的比较分析

Countess 3通过数字化分析彻底消除了主观误差，适合高通量样品检测与标准化实验环境。

十二、系统整体检测流程总结

1. 样品加载 →

2. 光学照明与图像采集 →

3. 图像预处理（去噪、增强） →

4. 自动聚焦与曝光优化 →

5. 细胞识别与分割 →

6. 活死判定与分类统计 →

7. 数据计算与报告生成。

该闭环系统实现了从物理信号到生物学结果的完整数据链条，构成Countess 3的检测核心原理框架。

十三、技术优势与应用价值

• 精准度高：基于AI算法识别细胞轮廓与染色特征，误差极小。

• 检测速度快：10秒完成一次完整计数。

• 可重复性强：算法标准化，避免操作者差异。

• 多模式适配：支持明场与荧光检测，兼容多种细胞类型。

• 数据可追溯：自动保存图像与分析记录，符合科研数据管理规范。

该仪器在细胞培养质量控制、药物毒性评估、转染效率分析、细胞周期研究及干细胞活性监测等领域均具有重要应用价值。