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一、概述

赛默飞细胞计数仪 Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter 是一款基于数字光学成像与智能算法的全自动细胞计数设备。为了获得准确、稳定、可重复的检测结果，样品的制备与质量控制至关重要。
仪器对样品的物理特性、浓度范围、均匀性、染色状态、体积及纯净度都有明确要求。任何不符合标准的样品，都会直接影响成像质量、细胞识别效率及活死细胞判定的准确度。

本章节旨在详细说明 Countess 3 在细胞检测过程中对样品的具体要求，包括样品来源、制备条件、体积要求、浓度区间、染料使用规范及样品稳定性管理。

二、样品类型与适用范围

Countess 3 适用于多种类型的悬浮或可离心分散的细胞。

1. 常用哺乳动物细胞

适合检测的细胞类型包括但不限于：

• HEK293、CHO、HeLa、Jurkat、NIH3T3 等贴壁细胞经胰酶消化后获得的悬浮液；

• 淋巴细胞、原代免疫细胞、肿瘤细胞系等。

2. 微生物与真核模型细胞

仪器也可用于部分酵母、藻类或真菌孢子样品的计数，但需注意细胞直径范围。建议在软件中调整检测范围至 3–10 µm 以适配小型细胞。

3. 特殊细胞样品

对于含有较多碎片、血浆或细胞外基质的样品（如原代组织消化液），建议先进行离心、过滤或稀释处理，确保样品清晰、分散。

三、样品浓度要求

样品浓度是影响检测精度的重要因素。Countess 3 的最佳检测浓度范围为 1×10⁴ 至 1×10⁷ cells/mL。

• 低于 1×10⁴ cells/mL：系统可能无法识别足够数量的细胞进行统计分析，导致偏差增大。

• 高于 1×10⁷ cells/mL：细胞重叠、聚集严重，会降低识别精度并产生重复计数现象。

若样品浓度超出范围，应进行适当稀释或浓缩。推荐使用无菌 PBS 或培养基进行稀释，保持细胞处于稳定悬浮状态。

四、样品分散性与均一性

为了确保图像识别清晰，细胞必须充分分散且形态完整。

1. 避免团聚

• 贴壁细胞消化时，需确保胰酶消化完全但不过度，以避免细胞损伤。

• 对易团聚的细胞，可轻轻吹打或短暂超声分散。

2. 均匀混匀
   检测前轻轻颠倒混匀，确保细胞在悬液中均匀分布。建议在加样前再次混匀，以防细胞沉降。

3. 清除杂质
   样品中若含有培养基残渣、死细胞碎片或气泡，会干扰识别算法，应在制样前离心洗涤 1–2 次。

五、样品体积与加载要求

Countess 3 检测所需样品体积较小，一般为 10 µL。

• 样品应通过移液枪准确取样，防止因体积不准造成浓度误差。

• 若使用一次性计数板，将 10 µL 样品滴入指定通道并轻压封闭；

• 若使用可重复计数板，应确保计数腔清洁无残留液滴。

加载过程中应避免产生气泡或样品分层。气泡会被系统误判为细胞，而液面不平会导致部分区域成像模糊。

六、样品溶液与介质要求

样品所处溶液环境影响光学成像效果及染料反应。

1. 常规溶液
   推荐使用 PBS（pH 7.2–7.4）或无酚红培养基。避免使用高蛋白或粘度较高的溶液，以防光线散射异常。

2. 含血清溶液
   若样品中含血清成分，可能在图像中形成背景颗粒。可通过 1000 g 离心 3 分钟后更换为新鲜缓冲液。

3. 避免使用高折射率介质
   含有大量蔗糖、甘油或其他增稠成分的缓冲液会影响光学对比度，不建议使用。

七、染色要求与活性检测

Countess 3 支持明场模式与台盼蓝（Trypan Blue）染色模式两种检测方式。

1. 明场模式（Brightfield）

无需染色，适用于单纯计数。样品应透明清晰、背景干净。

2. Trypan Blue 染色模式

用于检测细胞活性（区分活细胞与死细胞）。标准染色步骤如下：

1. 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液混匀；

2. 室温静置 2 分钟，让染料充分渗透死细胞；

3. 加入计数板后立即检测，避免染料长时间作用导致假阳性。

3. 染料纯度与稳定性要求

• 使用新鲜配制的台盼蓝溶液；

• 避免使用超过三个月的存储溶液；

• 染料应避光保存，防止降解。

八、样品保存与检测时效

样品制备完成后应尽快检测，以避免细胞状态改变。

• 建议在制备后 15 分钟内完成检测；

• 若短时无法检测，可将样品置于室温稳定环境中，不超过 30 分钟；

• 对于高温或低温敏感细胞，应避免剧烈温度变化。

长时间静置会导致细胞沉降或死亡比例升高，影响计数准确性。

九、样品稀释与浓缩处理

若样品浓度不在理想范围内，可进行以下调整：

1. 稀释处理
   使用 PBS 或无血清培养基进行倍数稀释。稀释倍数应记录，以便仪器自动换算浓度结果。
   例如：若 1:2 稀释，仪器读数需乘以 2 进行修正。

2. 浓缩处理
   若浓度过低，可离心（300 g，5 分钟），弃上清后重悬于较小体积缓冲液中。
   注意保持细胞完整性，不可用过高离心力。

十、温度与环境要求

样品检测时的环境条件会影响细胞形态与光学成像。

1. 温度
   建议室温 20–25 ℃。温度过高会导致细胞形态改变或染色加速。

2. 湿度
   保持环境湿度 40–70%，防止样品蒸发。

3. 光照
   检测前应避免强光直射，以免样品光学对比变化。

十一、特殊样品的处理建议

1. 高密度悬浮细胞

对如白血病细胞、Jurkat 等高密度样品，应先稀释 5–10 倍，再检测。

2. 含血细胞或组织碎片样品

必须经过滤网（40 µm）过滤，避免堵塞计数腔。

3. 含有细胞外囊泡或微粒的样品

建议启用背景修正功能，以区分细胞与微颗粒。

4. 对光敏感细胞

如荧光标记细胞，应避光操作并快速检测，防止光漂白。

十二、样品质量控制

为了保证每次实验结果的一致性，应建立样品质量标准。

1. 形态完整率
   形态良好、无裂解细胞应超过总数的 90%。

2. 无杂质与气泡
   背景清晰，无气泡与沉淀。

3. 均匀分布
   视野内细胞分布均匀，无明显聚集。

4. 活性稳定
   对于活性检测实验，染色后死细胞比例变化应在 10 分钟内稳定。

定期检测标准细胞株（如 HeLa）作为对照样品，以评估仪器性能与操作一致性。

十三、样品错误示例与处理

1. 样品浑浊或沉淀
   → 说明杂质过多或细胞聚集，应离心清洗。

2. 染色结果模糊不清
   → 检查染料是否过期或混合比例错误。

3. 检测重复性差
   → 可能因加样不均或样品浓度变化，应使用同一批样品多次检测验证。

4. 识别结果异常高
   → 背景噪点被误判，应调整灵敏度或更换缓冲液。

十四、样品准备的标准化流程

以下为 Countess 3 推荐的标准化样品准备步骤：

1. 收集细胞悬液（约 1 mL）；

2. 离心 300 g × 5 分钟，弃上清；

3. 用 PBS 重悬至目标浓度（约 1×10⁶ cells/mL）；

4. 若检测活性，取等体积台盼蓝混匀；

5. 取 10 µL 样品加载计数板；

6. 启动检测并保存结果。

通过统一的样品准备步骤，可以显著提高结果重现性，减少实验偏差。

十五、实验记录与数据追踪

每次检测应详细记录以下信息：

• 样品名称与来源

• 细胞类型及培养条件

• 染色方式与比例

• 稀释倍数

• 检测时间与温度

• 操作人及批次号

系统会自动保存图像与数据文件，用户可在导出后添加备注，形成完整的样品追踪记录，方便后续分析。