一、概述

QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪是赛默飞（Thermo Fisher Scientific）公司推出的新一代高性能qPCR平台，采用先进的多通道荧光检测系统，可在同一反应体系中实现多靶标同步检测。其光学模块集成高亮度LED光源、五通道滤光片组与高灵敏CCD检测器，具备高信噪比（S/N）、宽动态范围和优异的通道分辨能力。

荧光通道检测系统是QuantStudio 5实现实时定量和多重分析的核心组件。通过精确的光谱分离与光电信号采集，仪器能够实时监测荧光信号变化，生成扩增曲线、Ct值及定量数据，从而实现基因表达分析、病原体检测、突变识别等多种应用。

二、荧光通道检测系统的组成结构

QuantStudio 5的光学检测系统由以下部分构成：

1. 高亮度LED光源模块：提供多波段激发光，寿命长、稳定性高、能耗低；

2. 激发滤光片组（Excitation Filters）：选择特定波长光激发目标荧光染料；

3. 反应模块窗口：允许激发光照射样品并收集发射光；

4. 发射滤光片组（Emission Filters）：筛选目标荧光波段，排除杂散光；

5. 光学分光棱镜：实现多通道光谱分离；

6. CCD检测器：接收荧光信号并转换为数字信号；

7. 信号放大与数字化电路：将光电信号转化为可量化数据输入分析软件。

所有光路均经过高精度对准与封闭处理，确保低背景噪声和高光学稳定性。

三、荧光检测原理

荧光检测的基本原理是通过特定波长的激发光激发荧光染料分子，使其能级跃迁后释放出较长波长的发射光。检测系统捕获并量化发射光强度，从而反映反应体系中核酸扩增产物的积累量。

其信号变化规律可表示为：

$$F=k\cdot N$$

其中，F为荧光强度，N为扩增产物量，k为荧光常数。

在实时定量PCR中，荧光信号随循环数增加而指数上升。系统每个循环采集一次荧光强度，绘制扩增曲线，通过阈值点（Ct）计算样品中目标序列的初始拷贝数。

四、QuantStudio 5荧光通道配置

QuantStudio 5配置五个独立荧光检测通道，可同时检测五种不同染料信号。

通道间光谱重叠通过光学滤片及光谱解混算法校正。每个通道的检测线性范围可覆盖9个数量级，灵敏度可检测至单拷贝水平。

五、荧光通道检测模式

QuantStudio 5根据实验设计支持多种检测模式：

1. 单通道检测模式（Singleplex）：只使用一个荧光通道，适用于SYBR Green体系或单靶标检测；

2. 多通道检测模式（Multiplex）：多个荧光通道同步采集信号，实现多靶标共反应检测；

3. 参考通道检测模式（Passive Reference）：使用ROX通道作为内参，用于校正体系体积或光路波动；

4. 比值检测模式（Ratiometric Mode）：通过计算通道间信号比值实现高精度定量。

六、光谱分离与信号采集过程

1. 激发阶段：LED光源发出多波长激发光，经滤光片选择后照射样品。

2. 发射阶段：荧光染料吸收能量后发射光子；

3. 信号收集：光学系统通过发射滤光片与分光棱镜筛选目标波长光；

4. 信号检测：CCD检测器捕获发射光并转换为电子信号；

5. 信号处理：信号经放大、数字化后传输至软件进行曲线拟合与可视化。

整个检测过程在毫秒级完成，保证实时响应与高通量采集。

七、荧光通道校准

荧光通道校准（Spectral Calibration）是确保不同染料信号正确识别的关键步骤。

1. 校准目的

• 确定每种染料在各通道的光谱响应；

• 生成光谱解混矩阵，消除光谱重叠；

• 保证多重检测时的通道分离度。

2. 校准步骤

1. 插入Spectral Calibration Plate（光谱校准板）；

2. 软件中选择“Instrument Calibration → Spectral Calibration”；

3. 按提示执行自动校准程序；

4. 系统采集各染料通道的激发与发射数据；

5. 自动生成光谱矩阵文件（.spf）；

6. 校准完成后保存并应用到实验分析。

3. 校准频率

建议每6个月进行一次通道校准，或在更换滤光片、光源、软件升级后重新执行。

八、荧光染料兼容性与应用范围

QuantStudio 5支持多种主流荧光染料，兼容性如下：

同时支持Quasar、JOE、Cy3、Alexa系列染料，只需确认光谱与通道兼容。

九、通道性能指标

这些指标确保仪器在多重检测和低拷贝样品中仍具有高度准确性。

十、荧光信号分析与数据输出

1. 信号归一化

通过ROX内参信号校正体系差异：

ΔRn=FtargetFROX−FbaselineΔRn = \frac{F_{target}}{F_{ROX}} - F_{baseline}ΔRn=FROXFtarget−Fbaseline

2. Ct值计算

系统自动在扩增曲线指数区设定阈值，确定各通道Ct。

3. 扩增效率计算

由标准曲线斜率计算扩增效率E：

E=(10−1/slope−1)×100%E = (10^{-1/slope} - 1) \times 100\%E=(10−1/slope−1)×100%

4. 多通道数据整合

软件同时输出各通道Ct、ΔRn、曲线与Tm值，支持Excel导出与图谱叠加显示。

十一、常见荧光通道检测问题与处理

十二、多重检测中的通道优化策略

1. 选择光谱差异大的染料组合：避免FAM/VIC重叠，推荐FAM–ROX–Cy5–TAMRA。

2. 控制各通道信号强度均衡：防止强信号掩盖弱通道。

3. 保持探针浓度合理：过高会造成荧光串扰。

4. 执行通道增益校正：软件可微调通道灵敏度。

5. 确认激发波长兼容性：不同染料需匹配滤光片参数。

6. 使用标准板验证：确保每通道响应线性。

十三、荧光检测数据的验证与评估

在完成多通道检测后，可通过以下参数评估通道性能：

1. 信噪比（S/N）：荧光峰值与背景比值≥3；

2. 峰值稳定性：同一通道重复样Ct标准差≤0.3；

3. 线性回归度：R²≥0.99；

4. 交叉响应率：非靶标通道信号<5%；

5. 基线漂移度：波动≤0.02 ΔRn。

若任一指标不达标，应重新校准或优化体系。

十四、荧光检测在不同实验类型中的应用

1. 基因表达定量：通过FAM与VIC通道分别检测目标基因与内参基因，实现ΔΔCt计算；

2. 病原体检测：多通道可同时检测多种病毒核酸，提高检测效率；

3. SNP分型：利用FAM/VIC通道区分等位基因型；

4. 多靶标诊断：使用ROX、Cy5、TAMRA等染料进行多重病原体筛查；

5. 质量控制：ROX通道作为内参，用于校正光路与体系波动。

十五、通道检测性能维护与定期检查

保持良好维护可显著延长光学系统寿命并确保检测稳定性。

十六、安全与操作注意事项

1. 调试或校准前务必断电操作；

2. 禁止强光直射光学窗口；

3. 不得使用含丙酮或强酸的清洁剂；

4. 校准板需避光存放并定期更换；

5. 实验后及时关闭通道光源以延长LED寿命；

6. 任何通道异常应保存日志文件并报告工程师。