一、反应板设置的重要性

反应板设置是QuantStudio 5实验流程中的核心环节，它决定了系统如何识别样品、解析信号与生成分析数据。

1. 确保信号归属准确：每个孔位的样品信息、靶基因和荧光通道必须正确匹配，否则系统无法正确计算Ct值。

2. 避免通道重叠与误判：合理配置荧光通道，防止多重反应中信号串扰。

3. 提升数据分析效率：科学的板设置可在实验结束后快速生成扩增曲线与标准曲线，减少人工分类。

4. 保证统计学有效性：规范的重复与对照布局能确保结果具有可信度与可重复性。

二、反应板类型与兼容规格

QuantStudio 5支持多种反应板规格，用户可根据实验通量与样品数量灵活选择：

1. 96孔标准板（0.2 mL孔）

• 常用于基因表达定量、病原体检测等常规实验。

• 板体材质为高透明光学聚合物，适合多通道荧光检测。

2. 96孔快速反应板（0.1 mL孔）

• 与Fast模式配套使用，缩短热循环时间。

• 热传导效率高，升降温速率更快。

3. 384孔高通量反应板

• 适合大规模筛查、基因分型或药物敏感性分析。

• 孔间热平衡良好，支持高通量实时监测。

4. 单管与8联管

• 适用于小规模验证实验或预实验；

• 需要使用相应的光学适配器支撑。

三、反应板设置的基本原理

QuantStudio 5通过软件内置的“Plate Setup”模块实现反应板信息配置。系统通过定义每个孔的样品信息与目标检测项目，将实验设计逻辑与物理布局对应。其原理包括：

1. 孔位映射机制：每个孔（A1–H12）在软件中对应唯一编号。

2. 荧光通道绑定：不同目标基因信号通过特定通道采集（如FAM、VIC）。

3. 组别与对照定义：样品可分为标准、未知、阴性对照等类型，便于结果自动分类。

4. 重复性设定：设置技术重复数量，软件自动平均Ct值。

四、反应板设置的具体操作流程

1. 新建实验文件

打开QuantStudio Design & Analysis软件，选择“New Experiment”，并在实验类型中选定“Standard Curve”、“Relative Quantification”或“Genotyping”等。

2. 打开“Plate Setup”界面

在软件主界面点击“Setup”标签页，进入板设计界面。系统将显示标准96孔布局图（8行×12列）。

3. 样品信息输入

点击孔位或区域后，在右侧面板中输入：

• 样品名称（Sample Name）；

• 样品类型（Unknown / Standard / NTC）；

• 分组信息（Group Name）。

4. 目标基因定义

选择“Targets”选项卡，添加检测基因：

• 输入目标名称（Target Name）；

• 指定检测类型（SYBR / Probe）；

• 选择荧光通道（FAM、VIC、CY5等）；

• 设置参考染料（如ROX）。

5. 分配样品与目标

在板图中选择孔位后，将目标基因分配至样品。系统自动建立孔位矩阵关系。

6. 设置标准与对照

• 标准样品（Standard）：设定已知浓度值以建立标准曲线；

• NTC（无模板对照）：用于检测污染与非特异扩增；

• 阳性对照（Positive Control）：验证体系性能。

7. 设置技术重复

通过“Replicates”选项设置重复数，一般为三重复。系统自动标记重复孔并计算平均Ct值。

8. 保存板设置模板

完成后点击“Save Plate Setup”保存模板文件（.qsp），可在未来实验中直接调用。

五、荧光通道设置原则

QuantStudio 5支持多通道检测，应根据荧光探针光谱特性合理分配：

荧光通道设置要避免光谱重叠，尤其在多靶标检测中，应选择发射峰分离明显的染料组合。

六、样品布局策略

1. 对称分布原则
   技术重复样品应在板的不同区域分布，避免局部温度差影响Ct值。

2. 对照分布规则

• NTC应分布在边缘孔以防气溶胶污染。

• 标准曲线样品应按浓度递减排列，如A1–A6。

3. 多目标实验布局
   若进行双靶标或多靶标实验，每组样品应独立分配通道与孔位，避免混淆。

4. 内参基因与目标基因分布
   可在相邻孔布局，以便后期进行ΔCt计算。

5. 模板浓度梯度布局
   对于标准曲线实验，可设置10倍梯度稀释（10⁰–10⁻⁶），验证扩增效率。

七、ROX参考染料与校正设置

QuantStudio 5支持ROX作为被动参考染料，用于补偿因加样误差、光强波动引起的信号偏差。

1. 启用ROX校正：在板设置界面中选择“Passive Reference”，并设为ROX。

2. 校正原理：系统自动计算各孔荧光比值（FAM/ROX），从而归一化信号强度。

3. 适用体系：仅适用于含ROX的反应体系，如TaqMan Universal Master Mix。

八、板设置模板的复用与导入

QuantStudio软件支持模板复用功能，可显著提高实验效率：

1. 模板导出：在“Plate Setup”界面点击“Export Template”。

2. 模板导入：新建实验后选择“Import Template”，系统自动加载样品布局。

3. 模板校验：导入后检查样品名称、通道与目标基因匹配性。

九、反应板设置中的常见错误及解决方法

十、实验数据分析前的板设置验证

实验运行前，应执行以下验证操作以确保板设置正确：

1. 软件检查：点击“View Plate Layout”检查孔位标识是否正确。

2. 预览功能：模拟运行查看通道采集计划。

3. 对照验证：确认标准、阳性、阴性样品均已设置。

4. 保存与日志记录：记录每次板设计文件版本，便于追溯。

十一、反应板设置优化建议

1. 避免边缘效应
   在高温循环过程中，边缘孔蒸发略快，可在边缘孔加无模板反应体系以平衡热分布。

2. 使用透明封膜
   选择高透光率光学膜，防止信号衰减。

3. 孔位随机化设计
   对未知样品随机分布，降低系统性误差影响。

4. 自动化加样配合
   使用电动移液工作站或分配系统，提高加样一致性。

5. 标准与未知样品同板检测
   可避免跨板误差，提高定量准确性。

十二、反应板设置在不同实验模式中的应用

1. 绝对定量（Standard Curve）

• 设置多个已知浓度标准样品；

• 系统根据Ct值与浓度对数绘制标准曲线。

2. 相对定量（ΔΔCt法）

• 目标基因与内参基因分布在相邻孔；

• 计算ΔCt与ΔΔCt以分析表达倍数变化。

3. SNP分型（Genotyping）

• 每个孔对应一个样品与双探针反应体系；

• 通道设置为FAM/VIC，自动判定基因型。

4. 熔解曲线分析（Melt Curve）

• 所有样品在单一通道（SYBR Green）检测；

• 无需设置多重通道，但需确保均一扩增。

十三、质量控制与维护

1. 板清洁与封膜

• 加样前检查板表面无指纹与灰尘；

• 使用专用封膜滚轮压紧边缘。

2. 反应板放置

• 放入仪器前检查方向标识（A1孔对齐左上角）；

• 不可倾斜或晃动，防止液体混合。

3. 使用寿命管理

• 一次性反应板禁止重复使用；

• 长期保存板模板文件以便追溯。

十四、反应板设置与数据关联

反应板设置不仅是实验前操作步骤，更是数据分析的关键参数。所有Ct值、扩增曲线与熔解分析均依赖于板文件信息。

1. 系统在采集数据时按孔位索引匹配信号；

2. 若设置错误，会导致信号错位或无法生成曲线；

3. 软件分析时依据“Sample–Target–Well”三维矩阵计算Ct值与扩增效率。