赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5试剂准备流程
一、试剂准备的重要性
在实时荧光定量PCR实验中，试剂的准确配比直接决定扩增效率（E值）、荧光信号稳定性和Ct值可靠性。QuantStudio 5依赖荧光信号的实时采集来计算扩增曲线，如果反应体系存在成分偏差或抑制物，将导致荧光变化异常或扩增延迟。
高质量的试剂准备能够确保：
扩增效率稳定：理想效率应在90%–110%之间；
Ct值重复性好：同一样品重复差异≤0.3；
荧光信号平滑：基线区稳定，无波动或漂移；
熔解曲线单峰：代表产物特异性良好。
因此，在上机实验前，所有试剂的浓度、纯度与配比都应严格控制，避免人为误差。
二、QuantStudio 5实验常用试剂组成
QuantStudio 5适用于多种qPCR检测体系，最常用的包括SYBR Green染料法与TaqMan探针法。两种体系所需试剂组成略有不同。
1. SYBR Green体系
| 组分 | 主要功能 | 推荐浓度（反应体系20 μL） |
|---|---|---|
| 2× SYBR Green Master Mix | 含Taq酶、dNTPs、MgCl₂、缓冲液及荧光染料 | 10 μL |
| 上游引物（Forward Primer） | 与目标序列结合 | 0.4 μL（200 nM） |
| 下游引物（Reverse Primer） | 与目标序列反向结合 | 0.4 μL（200 nM） |
| 模板DNA/cDNA | 扩增对象 | 1–2 μL（10–100 ng） |
| 无RNA酶水 | 体积补足 | 补至20 μL |
2. TaqMan探针体系
| 组分 | 功能 | 推荐浓度（反应体系20 μL） |
|---|---|---|
| 2× TaqMan Master Mix | 含酶、缓冲液、MgCl₂ | 10 μL |
| 上游引物 | 靶序列识别 | 0.4 μL（300 nM） |
| 下游引物 | 靶序列识别 | 0.4 μL（300 nM） |
| 探针 | 特异性检测荧光释放 | 0.2 μL（200 nM） |
| 模板DNA/cDNA | 检测目标 | 1–2 μL |
| 无RNA酶水 | 补足体积 | 至20 μL |
两种体系的选择取决于实验目标。若仅需检测扩增情况或相对表达量，SYBR体系足够；若需要特异性更高的定量分析或多靶标检测，则推荐TaqMan探针法。
三、试剂准备的基本要求
使用高纯度试剂
所有试剂必须具备分子生物学级纯度，避免蛋白酶、DNA酶或RNA酶污染。低温环境操作
试剂在4℃或冰上准备，避免酶活性提前启动。无核酸污染操作环境
建议在PCR前处理区进行试剂准备，使用专用移液器和滤芯枪头。精准量取
采用校准过的移液枪，误差不超过2%。充分混匀但避免起泡
混匀后短暂离心，使体系均匀沉底。防止交叉污染
每次加样后立即更换枪头，反应板或管盖随取随盖。
四、反应体系配置流程
QuantStudio 5实验反应体系的配置应遵循“主混合液（Master Mix）优先”的原则，减少样品间误差。
1. 准备主混合液（Master Mix）
根据实验需求计算所需体系总量，并增加10%冗余量以补偿移液损耗。例如：
若每个反应体系为20 μL，需检测40个样品，则总体系=40 × 20 μL × 1.1 = 880 μL。
配置顺序如下：
在洁净离心管中加入2× Master Mix；
加入上、下游引物（若探针法则加入探针）；
加入无RNA酶水至总体积；
混匀离心，短暂放冰上备用。
2. 分装主混合液
使用移液枪将Master Mix按每孔设定体积分配到96孔反应板中（例如每孔18 μL）。
3. 加入模板DNA/cDNA
将模板加入各自孔中（一般1–2 μL），轻轻混匀。模板的加入顺序应严格按照实验设计，避免样品混淆。
4. 密封反应板
使用专用光学封膜并用滚轮压实，确保无气泡与渗漏。气泡会导致光学检测干扰和信号不稳定。
5. 短暂离心
将反应板放入离心机中（1500 rpm，10秒）以去除气泡并使液体沉底。
五、试剂浓度与反应优化
QuantStudio 5对体系浓度较为敏感，尤其是引物与Mg²⁺浓度的微小变化都会影响扩增效率。
引物浓度优化
初始浓度建议为200–400 nM；
若扩增效率低，可适当增加至500 nM；
若出现引物二聚体或非特异性扩增，适当降低浓度。
探针浓度调整
探针过量会增加背景信号，推荐范围150–250 nM。模板浓度控制
对于cDNA模板：1–100 ng/μL；
对于基因组DNA：10–100 ng/μL；
若模板浓度过高，可能出现平台效应或荧光饱和。
Mg²⁺浓度
Mg²⁺是Taq酶活性的关键离子，过低影响扩增速率，过高易形成非特异性产物。Master Mix中通常已优化，无需额外添加。
六、试剂保存与使用注意事项
Master Mix保存条件
长期保存：–20℃避光保存；
短期使用：4℃可保存1周；
避免反复冻融超过5次，否则酶活性下降。
引物与探针保存
储存浓度：100 μM原液，分装后–20℃保存；
工作液（10 μM）可在4℃保存1周；
避免长时间暴露光照。
模板DNA/cDNA保存
DNA可长期保存于–20℃；
cDNA建议短期使用，避免降解。
使用前复融
所有冻存试剂使用前应充分复融并轻轻混匀；
不可剧烈震荡，以免破坏酶结构。
七、试剂准备过程中的质量控制
QuantStudio 5实验对重复性要求高，因此试剂准备阶段应建立严格的质量控制点：
空白对照（NTC）设置
每次实验必须设置无模板对照，以检测体系污染。阳性对照设置
用已知模板验证体系性能与扩增效率。内参基因检测
用于基因表达分析中信号归一化，常用GAPDH、β-actin等。反应板均一性验证
确保每孔加样一致，Ct差异≤0.3。数据初检
运行前可通过预实验检测曲线形态与熔解曲线特征。
八、不同类型样品的试剂准备差异
基因组DNA检测
模板复杂度高，建议使用探针法；Master Mix中酶浓度可略高。RNA样品（逆转录后）
应确保RNA纯度，A260/A280=1.8–2.0；若RNA残留抑制物，应使用RNA清除试剂。环境样品或临床样品
需加入反应增强剂（如BSA）以缓解抑制作用。多重扩增实验（Multiplex PCR）
不同探针需在荧光通道间区分；探针浓度应按通道信号强度微调。
九、试剂准备中的常见问题与解决方案
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| Ct值过高 | 模板浓度低、酶活下降 | 增加模板量或更换试剂 |
| 曲线不平滑 | 混匀不充分、气泡干扰 | 离心去泡并重新封膜 |
| NTC有信号 | 污染或引物二聚体 | 更换枪头、重新配制体系 |
| 多峰熔解曲线 | 非特异性扩增 | 提高退火温度或优化引物 |
| 信号过弱 | 荧光染料降解 | 避光保存试剂并检查有效期 |
| 不同孔Ct差异大 | 加样不均或液体蒸发 | 检查移液精度与封膜密封性 |
十、试剂配制的标准化管理
分区操作
样品处理、反应体系配置、扩增后分析应分区进行，防止交叉污染。耗材一致性
使用赛默飞光学板与封膜，保证光学性能匹配。批次记录
记录每批试剂的批号、开封时间、储存条件与使用情况。定期校准
对移液器进行季度校准，确保加样精度。实验复核制度
每次体系配置应有两人交叉核对，确认试剂配比与加样顺序。
十一、试剂准备实例
示例：基因表达分析实验（SYBR Green体系）
反应体系总量20 μL（每样品三重复）：
2× SYBR Master Mix：10 μL
Forward Primer（10 μM）：0.4 μL
Reverse Primer（10 μM）：0.4 μL
模板cDNA：1 μL
无RNA酶水：8.2 μL
步骤：
按上述比例在冰上配制Master Mix；
分装至反应板中；
加入模板后轻轻混匀；
封膜、离心、上机运行；
设置热循环程序：
95℃ 2 min；
40 cycles（95℃ 10 s，60℃ 30 s）；
熔解曲线60–95℃。
十二、反应前检查与运行准备
检查反应板底部无气泡、液面平整；
确认热盖温度（105℃）已设定；
选择正确的荧光通道与模板布局；
保存实验模板文件以便后续分析。
