一、概述

QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪是赛默飞公司推出的高性能荧光检测系统，广泛用于基因表达分析、突变检测、病毒定量、转录水平研究及多重荧光探针实验。实验完成后，软件将根据采集的荧光信号自动生成一系列结果图谱，包括扩增曲线、标准曲线、熔解曲线、差异表达图、基因分型图及热图（Heat Map）等。这些图谱不仅反映PCR反应的动态变化过程，也是结果判定、数据分析与质量控制的重要依据。

结果图谱的生成是QuantStudio软件分析模块的核心功能之一，它通过算法处理原始荧光信号，将定量信息可视化，帮助研究者直观判断扩增质量、计算Ct值、评估扩增效率和区分样品分型。

二、结果图谱的生成原理

QuantStudio 5在PCR循环过程中实时监测荧光信号变化。荧光信号与目标DNA扩增量成正比，系统通过算法对信号进行处理后生成图谱。

1. 荧光信号采集：
   每个循环结束后在退火或延伸阶段采集荧光强度数据。

2. 基线校正（Baseline Correction）：
   软件自动识别前几个循环中信号稳定区作为基线，减去背景荧光。

3. 阈值设定（Threshold Setting）：
   在指数增长区设定一条固定阈值线，当扩增曲线达到该线时对应的循环数即为Ct值。

4. 数据拟合与平滑化：
   通过数学模型对曲线进行平滑与指数拟合，减少噪声影响。

5. 可视化渲染：
   最终将处理后的荧光数据以曲线、散点、柱状或热图等形式显示，即结果图谱。

三、主要图谱类型及其含义

1. 扩增曲线（Amplification Plot）

扩增曲线是定量PCR的核心图谱，展示荧光信号随循环次数的变化趋势。

• 横轴（X轴）：循环次数（Cycle Number）

• 纵轴（Y轴）：荧光强度（ΔRn）

曲线分为三个阶段：

1. 基线阶段：早期循环中荧光变化不明显；

2. 指数阶段：扩增进入稳定增长期，信号显著上升；

3. 平台阶段：反应物耗尽，曲线趋于平稳。

理想的扩增曲线应平滑、单峰且指数阶段明显。通过此图可判断反应体系是否正常、是否存在抑制、气泡或蒸发等问题。

2. 标准曲线（Standard Curve）

用于定量分析的图谱，通过一系列已知浓度的标准模板绘制Ct值与log浓度的关系。

• 横轴（X轴）：模板浓度对数（log copy number）

• 纵轴（Y轴）：Ct值

线性拟合方程为：

$$Ct=a\times \log (C)+b$$

其中，斜率（a）反映扩增效率，R²表示线性相关性。
理想条件下，斜率约为−3.32（对应效率100%），R²应≥0.99。

标准曲线是计算未知样品浓度的依据。

3. 熔解曲线（Melting Curve）

适用于SYBR Green体系，用于验证扩增产物特异性。

• 横轴：温度（°C）

• 纵轴：荧光导数信号（−dF/dT）

当温度升高导致双链DNA解链时，荧光信号急剧下降，形成单一峰值。

• 单一尖锐峰：说明扩增特异；

• 多峰或肩峰：可能存在非特异产物或引物二聚体。

熔解曲线分析是验证实验可靠性的关键。

4. 差异表达图（Relative Quantification Plot）

用于基因表达差异分析，通过ΔΔCt法计算样品间相对表达量。

软件根据目标基因与内参基因的Ct值生成柱状或折线图，显示不同处理组间的表达倍数变化。

• 柱高代表相对表达量；

• 误差线表示重复孔差异；

• 对照组通常标准化为1。

该图谱直观展示不同样品的基因表达差异，是分子生物学研究常用结果形式。

5. 基因分型图（Allelic Discrimination Plot）

适用于SNP检测或基因突变分析。

• 横轴（X轴）：一个通道（如FAM）荧光强度；

• 纵轴（Y轴）：另一通道（如VIC）荧光强度。

不同等位基因的样品会在坐标图中形成聚类分布：

• FAM阳性 → A型；

• VIC阳性 → B型；

• 双阳性 → 杂合型；

• 无信号 → 阴性。

QuantStudio软件自动执行聚类算法，对样品进行分型判定并以不同颜色区分群体。

6. 多重检测热图（Heat Map）

用于多靶标、多样品的综合分析。

• 横轴：样品编号

• 纵轴：检测靶标

• 颜色深浅：荧光强度或表达量

热图能在高通量实验中快速显示不同样品之间的差异，常用于病毒筛查、基因面板检测及多靶标表达分析。

四、结果图谱生成操作步骤

步骤一：打开实验文件

在QuantStudio Design & Analysis软件中打开完成的实验文件（*.eds）。

步骤二：选择分析模式

点击“Analysis Settings”，选择实验类型：

• Quantitation（定量分析）

• Melt Curve（熔解曲线）

• Genotyping（基因分型）

不同模式将生成相应图谱。

步骤三：设置阈值与基线

在扩增曲线界面调整阈值位置；
若自动计算不准确，可手动选择指数区间。

步骤四：执行数据分析

点击“Analyze”按钮，系统自动计算Ct值、绘制曲线并生成图谱。

步骤五：图谱查看与调整

可通过“View”菜单选择显示模式：

• Amplification Plot

• Standard Curve

• Melt Curve

• Relative Quantification Plot

• Allelic Discrimination Plot

每种图谱均可放大、缩放、调整坐标轴比例或导出图片。

步骤六：导出与保存

分析完成后，可导出图谱文件为PDF、PNG或Excel格式：

• File → Export → Chart Image

• File → Export → Report

建议保存原始数据文件以便日后重新分析。

五、结果图谱的判读与质量评估

1. 扩增曲线判读

• 平滑单一曲线 → 正常扩增；

• 提前出现Ct值 → 污染或高模板浓度；

• 异常波动或平台不平 → 液体蒸发或气泡干扰；

• 平行孔曲线重叠度高 → 重复性良好。

2. 标准曲线判读

• 线性好（R²≥0.99）说明定量准确；

• 斜率偏大（>−3.6）表明扩增效率低；

• 斜率偏小（<−3.0）可能为污染或体系过浓。

3. 熔解曲线判读

• 单峰 → 特异扩增；

• 多峰 → 引物二聚体或非特异扩增；

• 异常峰温度偏低 → 短片段或假阳性。

4. 基因分型图判读

• 聚类清晰 → 分型可靠；

• 聚类重叠 → 染料串扰或信号弱；

• 孤立点 → 异常样品或操作误差。

六、数据再处理与二次分析

QuantStudio软件支持二次数据分析，可重新生成或优化结果图谱。

1. 重新定义样品组：在Analysis Settings中调整样品分组；

2. 手动修改阈值：对低信号样品可单独调整；

3. 重新分析曲线：使用“Reanalyze”功能更新所有结果；

4. 多实验比较：可叠加不同实验数据生成综合图谱；

5. 输出统计结果：包括Ct均值、标准差、扩增效率及倍数变化。

七、结果图谱常见问题及解决方案

八、结果图谱的科学应用

1. 基因表达分析：通过扩增曲线与差异表达图可比较不同样品间基因表达水平。

2. 病原体定量检测：标准曲线提供绝对定量基础，可评估病毒载量。

3. 突变与SNP分型：分型图谱准确区分不同等位基因。

4. 质量控制：熔解曲线与扩增曲线共同验证实验特异性。

5. 药物反应与通路研究：热图展示不同样品在多靶标检测中的表达模式。

九、优化结果图谱的关键技术要点

1. 确保反应体系均一：避免孔间差异导致曲线偏移。

2. 选择适宜阈值：过高或过低均会导致Ct计算误差。

3. 光谱校准：确保多通道信号分离准确。

4. 去除异常数据点：排除气泡、污染或加样误差孔。

5. 统一分析参数：对同一实验应使用相同基线和阈值标准。

6. 图谱输出标准化：调整比例与颜色方案，便于报告展示。

十、报告输出与展示规范

QuantStudio软件可自动生成报告，包含各类图谱与统计结果。
建议报告内容包括：

• 扩增曲线图；

• 标准曲线图及方程；

• 熔解曲线图；

• 差异表达柱状图；

• 基因分型散点图；

• 热图（若有多重检测）；

• Ct值表与统计数据。

报告文件可导出为PDF、Excel或HTML格式，适用于科研论文与检测报告提交。

十一、典型案例

在病毒载量定量实验中，使用FAM标记的探针进行检测。实验完成后，生成的结果图谱如下：

• 扩增曲线呈典型S型，Ct约为22；

• 标准曲线R²=0.998，扩增效率为97%；

• 熔解曲线单峰，Tm值82.5°C；

• 差异表达图显示阳性样品较对照组上升约50倍；

• 热图显示多靶标检测中各病毒类型信号区分明显。

该实验表明QuantStudio 5结果图谱清晰、可重复、可定量，为分子诊断提供高可靠性视觉化结果。