赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5实验注意事项
一、概述
QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪是赛默飞公司开发的高性能定量检测设备，广泛用于基因表达分析、突变检测、病原体筛查及药物基因学研究。作为一类高灵敏度分子检测仪器，其实验结果的准确性不仅依赖于设备本身的光学与温控精度，也高度依赖于操作者的实验规范与细节控制。
本文件旨在为科研及检测人员提供系统化的操作注意事项，涵盖实验前准备、反应体系配置、加样操作、运行监控、数据分析及后期维护等多个方面，帮助用户有效避免误差与污染，确保结果可靠性与实验可重复性。
二、实验前准备
1. 实验环境要求
温度与湿度：保持实验室温度20–25°C，相对湿度30–70%，防止仪器光学系统受潮。
洁净度：实验区域应无尘、无振动；PCR区应与样品提取、产物分析区分开。
防污染设计：建议设立独立的加样区与扩增区，使用紫外灯定期灭菌。
2. 仪器状态检查
开机前确认仪器处于干燥、平稳状态；
检查电源线连接稳固；
观察系统指示灯是否正常（绿色表示准备就绪）；
确认仪器内部温控模块与光学组件清洁无尘；
若出现任何报警提示，应先运行系统自检程序（System Check）。
3. 软件与数据准备
启动QuantStudio Design & Analysis Software并登录用户账户；
检查软件版本是否为最新；
建立新的实验模板（Experiment Template），设定实验类型、反应体积与荧光通道；
确认实验板布局文件准确，避免样品与靶标配错。
三、反应体系与样品准备注意事项
1. 试剂管理
所有试剂应存放于指定温度条件下（通常−20°C）；
使用前需完全解冻并轻轻混匀；
避免反复冻融以防酶失活；
检查试剂有效期并记录批号。
2. 模板处理
样品纯度对结果影响显著，应避免蛋白质、乙醇或盐离子污染；
建议通过紫外分光仪或荧光定量仪检测模板浓度与纯度（A260/A280≈1.8–2.0）；
稀释模板时使用无核酸酶水（RNase/DNase-free）；
若模板浓度过高，可能引起荧光饱和或曲线异常，应进行10倍系列稀释。
3. 引物与探针
使用高纯度HPLC纯化引物；
储存于−20°C，避免反复冻融；
检查Tm值与GC含量匹配（GC含量40–60%，Tm约58–62°C）；
探针染料应与仪器通道兼容（如FAM、VIC、ROX、Cy5等）；
不同实验间避免共用探针以防交叉污染。
4. 反应体系配制
在洁净操作台内进行，使用滤芯吸头；
建议先制备Master Mix母液，确保各孔一致；
模板加入应最后完成；
加样顺序保持一致性，避免时间差引起反应偏移；
每次操作完毕立即封板并离心收集液体。
四、实验板与封膜操作
反应板应为QuantStudio专用光学板（96孔或384孔）；
加样完成后，使用专用透明封板膜密封；
检查膜面平整无气泡，否则会影响光学信号；
封板后使用低速离心机（约1500 rpm，10秒）使液体集中到底部；
不可使用普通封口膜替代光学膜；
样品编号应与软件设置一致，防止数据错位。
五、仪器运行前检查
反应板放置：确保板边缘对准定位槽；
上盖温度：设置为105°C，防止反应液蒸发；
程序设置：检查预变性、退火及延伸温度是否正确；
通道选择：确认各靶标的荧光通道配置无误；
数据采集阶段：选择在退火或延伸阶段采集荧光信号；
样品重复：建议每组样品至少设置三重复孔；
阴阳性对照：每板均需设置无模板对照（NTC）与阳性对照样品。
六、运行过程中的注意事项
实验运行期间请勿打开上盖或移动仪器；
避免在仪器运行时进行震动操作，如离心或搬运；
观察软件运行界面中实时曲线，若出现异常波动，可暂停并重新校准；
运行结束后等待系统提示“Run Complete”后再取出反应板；
若仪器提示温控或光学错误，请保存日志文件并联系技术支持。
七、数据分析注意事项
1. 基线与阈值设定
使用自动基线模式，系统根据早期循环荧光稳定区确定基线；
若自动结果不理想，可手动调整基线范围（通常Cycle 3–15）；
阈值应设置在指数增长区与基线区之间。
2. Ct值判定
正常Ct范围通常为15–35；
若Ct<10，可能为模板污染；
若Ct>38或无Ct，应检查体系或模板量；
重复孔Ct标准差应≤0.3。
3. 标准曲线与扩增效率
标准曲线R²≥0.99，扩增效率应在90–110%；
若效率偏离范围，需检查引物设计或体系浓度。
4. 熔解曲线分析
SYBR Green实验需检查熔解峰单一性；
若出现双峰或肩峰，说明存在非特异扩增或引物二聚体。
5. 数据导出与保存
实验完成后保存原始文件（.eds）；
可导出Excel或PDF报告用于统计；
建议定期备份实验数据至外部存储。
八、避免污染与误差的关键措施
加样区、反应区与分析区分离；
所有操作均应使用滤芯吸头；
试剂分装应在无模板区完成；
定期更换手套，避免手部携带DNA污染；
加样后立即封板并擦拭外表残液；
每次实验后用70%乙醇清洁台面与仪器表面；
若发现NTC孔出现信号，应全面清理并更换耗材。
九、通道与荧光检测注意事项
选择染料应与通道匹配，避免光谱重叠；
在进行多重检测前，必须完成通道光谱校准；
染料组合应优先选择FAM/VIC/ROX/Cy5；
若通道信号较弱，可适当延长采集时间；
不同实验使用相同通道时，应统一阈值设置；
光学系统保持清洁，防止荧光散射影响信号强度。
十、实验重复性与一致性控制
建议同一批样品在同一反应板中检测；
实验条件（温度、体系、程序）需保持一致；
使用相同批次的试剂和引物；
若跨天实验，应设立内部校准标准样；
定期检测仪器的温控均匀性与光学性能；
避免不同操作者使用不同模板稀释方式。
十一、安全与设备保护
使用仪器前阅读安全操作手册；
实验过程中避免液体溅入反应模块；
禁止在通电状态下移动仪器；
实验结束后关闭电源并覆盖防尘罩；
定期检查接地与电压稳定性；
若仪器长时间停用，应每月开机运行自检一次。
十二、常见问题与处理建议
| 问题 | 可能原因 | 处理措施 |
|---|---|---|
| 曲线无上升 | 模板丢失或体系错误 | 检查模板质量及试剂浓度 |
| Ct值过高 | 模板浓度低或扩增效率差 | 增加模板量或优化引物 |
| Ct值过低 | 污染或阈值设置不当 | 重新设定阈值并检测污染 |
| NTC孔阳性 | 环境污染 | 更换耗材并清洁操作区 |
| 信号漂移 | 光学腔污染或光源衰减 | 清洁光学组件或重新校准 |
| 曲线不平滑 | 样品蒸发或混合不均 | 检查封膜与混匀步骤 |
| 扩增效率低 | Mg²⁺或dNTP浓度不平衡 | 优化体系组分 |
十三、实验记录与质量追溯
每次实验应填写《PCR实验记录表》，包括：
实验日期、操作者；
试剂批号与配制比例；
样品编号与板布局；
仪器序列号与软件版本；
异常记录及处理情况。
所有原始数据文件应与实验记录一并保存，保证可追溯性。
若用于检测服务或认证实验，应定期审查记录完整性与数据一致性。
十四、结果验证与报告生成
对结果可疑的样品应重复检测确认；
标准曲线外推的结果应谨慎使用；
实验报告需包含实验条件、扩增曲线、Ct值表及分析结论；
若用于科研发表，应保留所有原始分析文件以备查验。
十五、设备维护与清洁周期
| 项目 | 周期 | 维护内容 |
|---|---|---|
| 光学窗口 | 每周 | 用无水乙醇擦拭干净 |
| 反应模块 | 每次实验后 | 检查残液、保持干燥 |
| 上盖密封圈 | 每月 | 检查老化情况 |
| 系统校准 | 每6个月 | 执行光谱与温控校准 |
| 软件更新 | 每年 | 保持最新版本 |
| 环境清洁 | 每日 | 紫外消毒与台面擦拭 |
十六、关键操作总结
实验前应校准仪器，确认光学系统状态正常；
加样操作保持清洁、快速且顺序一致；
设置对照孔与重复孔，保证结果可验证；
控制好反应体系体积及模板浓度；
检查每次实验的基线与阈值是否合理；
遇到异常结果需重新验证或复测；
实验结束后进行清洁维护并备份数据。
