一、概述

通道校准（Channel Calibration）是QuantStudio 5荧光定量PCR仪确保多通道检测准确性的核心步骤。该过程通过测定并记录仪器对不同荧光染料的光谱响应，建立光谱解混矩阵，使仪器能够在多重检测实验中正确区分各荧光信号，保证荧光强度、Ct值和定量结果的准确性。

QuantStudio 5支持五通道检测系统，可用于SYBR Green、FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA等多种荧光染料。由于不同通道的激发与发射光谱存在重叠，若未经校准，信号会出现串扰或识别偏差，导致定量误差。通道校准能消除这种干扰，为荧光信号分离和数据分析提供数学基础。

二、通道校准的原理

1. 光谱特征与通道重叠

每种荧光染料都有特定的激发波长和发射波长，但多通道系统的滤光片宽度有限，不同染料的光谱带存在部分重叠。例如FAM（520 nm）与 VIC（555 nm）在发射谱上存在交叉区。

QuantStudio 5通过光谱分解算法（Spectral Unmixing）区分这些重叠信号。为实现该算法，必须预先校准各染料的光谱响应。

2. 光谱矩阵原理

在通道校准中，仪器测定每种染料在不同检测通道的响应强度，构建一个光谱响应矩阵M：

$$I=M\times C$$

其中：

• I：各通道检测到的总信号向量；

• M：荧光染料在各通道的响应系数矩阵；

• C：真实染料信号强度向量。

通过矩阵反演，系统即可计算出每个染料的真实强度，实现信号解混。

3. 校准的目的

• 建立标准光谱模板文件（Spectral Calibration File）；

• 校正通道间灵敏度差异；

• 消除光学滤光片老化、光源衰减等影响；

• 提高多重检测的荧光分辨率。

三、QuantStudio 5通道结构

QuantStudio 5采用五通道独立检测系统，结构如下：

每个通道由独立滤光片组与光学检测元件组成。通道校准的核心是测定这些滤光片对特定荧光染料的响应曲线。

四、通道校准的适用场景

1. 初次安装仪器或更换光源、滤光片后；

2. 软件升级后系统提示需重新校准；

3. 新增或更换染料类型时；

4. 进行多重qPCR实验前；

5. 通道信号出现异常或串扰现象时；

6. 每6个月进行一次定期维护校准。

五、通道校准所需材料与工具

六、通道校准操作步骤

步骤一：准备工作

1. 确保仪器通电并完成自检；

2. 检查实验室温度与湿度符合要求（20–25°C，30–70% RH）；

3. 清洁光学检测窗口与反应模块表面；

4. 启动QuantStudio软件并连接仪器；

5. 打开上盖，准备放置校准板。

步骤二：加载校准板

1. 从包装中取出Spectral Calibration Plate；

2. 将其放置于样品槽内，对准定位孔；

3. 关闭上盖并确认密封良好。

注意：校准板表面含固定荧光染料，避免强光照射与污染。

步骤三：选择校准模式

1. 在软件菜单中选择 “Maintenance → Instrument Calibration”；

2. 选择 “Spectral Calibration”；

3. 在弹出窗口中选择需要校准的通道组合（例如FAM/VIC/ROX/Cy5/TAMRA）；

4. 点击“Next”进入校准设置界面。

步骤四：执行校准

1. 软件提示“Insert Calibration Plate”，确认后点击“Start”；

2. 仪器依次激发各通道荧光信号，采集光谱响应数据；

3. 过程大约需要10–15分钟；

4. 完成后系统自动计算各通道的荧光响应矩阵并生成报告。

校准期间仪器盖板将保持关闭，避免外界光干扰。

步骤五：保存与验证

1. 校准结束后，系统生成新的光谱文件（*.spf）；

2. 在弹窗中选择“Save to Instrument”；

3. 若启用云端同步，文件将上传至Thermo Fisher Cloud；

4. 可在软件中查看光谱曲线与通道分离效果；

5. 若任何通道显示异常，重复校准或仅校准异常通道。

七、光谱曲线与数据分析

校准完成后，系统生成每个染料在各通道的响应曲线。

1. 光谱响应图

横轴为波长，纵轴为相对荧光强度。理想曲线应呈单峰分布且峰值位于该通道中心波长附近。

2. 交叉响应矩阵

QuantStudio软件计算每种染料在所有通道的相对响应系数。例如：

理想情况下，各染料主通道响应应>90%，交叉响应<5%。

3. 校准结果评估

若任何通道交叉系数>10%，说明存在光学污染或滤光片漂移，应重新执行校准。

八、校准文件管理

1. 文件类型

• 光谱文件（.spf）：包含通道响应系数矩阵；

• 校准日志（.log）：记录日期、操作者与结果；

• 校准报告（.pdf/.html）：可导出用于质控审计。

2. 文件保存与备份

• 每次校准后系统自动覆盖旧文件；

• 建议同时保存至外部U盘或服务器；

• 可通过“Instrument Settings → Export Calibration File”导出备份。

3. 文件验证

当启动新实验时，软件将自动加载最新的校准文件；
可在“Instrument Properties → Calibration Info”中查看文件日期与版本号。

九、定期校准周期建议

如频繁使用多重检测或环境条件变化较大，可适当缩短周期。

十、校准异常与排查方法

十一、校准后验证实验

校准完成后应执行验证实验，以确认校准文件的准确性。

1. 单染料验证

使用FAM、VIC、ROX、Cy5等单染料反应，运行快速扩增实验。
结果应显示各通道仅有对应信号，其余通道背景<0.05 ΔRn。

2. 多重检测验证

在同一反应中加入多种探针，运行多重qPCR；
验证软件是否能正确区分曲线并计算各靶标Ct值。

3. 重复性验证

重复实验3次，检查Ct标准差≤0.3，表明校准一致性良好。

十二、维护与注意事项

1. 校准前务必清洁光学窗，避免尘粒影响信号；

2. 校准板应避光存放，使用寿命一般为1年；

3. 禁止重复使用被污染的校准板；

4. 校准时保持实验室光线稳定，避免外界干扰；

5. 若仪器长时间未使用，应重新执行校准后再开展实验；

6. 校准后请重新启动软件，以确保光谱文件加载成功。

十三、通道校准与数据分析的关系

通道校准文件是数据分析算法的基础。若校准不准确，可能出现：

• 多重检测中曲线串扰，导致假阳性；

• 某通道Ct偏低或偏高；

• 熔解曲线形态异常；

• 分型聚类图重叠。

因此，定期校准不仅影响荧光识别，还直接决定结果的科学性与重复性。

十四、质量控制与记录管理

所有校准操作应纳入实验室质量体系管理：

• 建立《仪器校准记录表》；

• 记录校准时间、通道名称、结果与确认人；

• 校准报告应归档保存至少5年；

• 通过LIMS系统可追溯每次校准文件版本与使用历史。

十五、通道性能优化建议

1. 定期检测信噪比（S/N）：信噪比≥200为理想状态；

2. 平衡通道灵敏度：若某通道信号偏低，可在软件中进行通道增益调整；

3. 校正背景亮度：通过软件“Baseline Offset”功能微调；

4. 避免通道过饱和：荧光强度应控制在检测范围内；

5. 光源预热：开机后至少预热10分钟，确保稳定输出。

十六、应用示例

案例1：多重病原体检测

研究者在一次四重检测中使用FAM、VIC、ROX、Cy5四种探针。经通道校准后，各靶标Ct值差异小于0.4，信号分离度>95%。说明通道分离清晰，检测准确。

案例2：校准文件失效导致误判

某实验室因长时间未校准导致光谱漂移，FAM与VIC信号交叉，出现假阳性。重新执行光谱校准后，通道识别恢复正常，标准曲线线性度从R²=0.96提升至0.999。