一、概述

多重检测（Multiplex Real-Time PCR）是指在同一反应体系中同时扩增并检测多个不同靶标基因，通过不同荧光通道区分检测信号的技术。该方法能显著提高样品检测效率、节约试剂成本、减少实验误差，并在临床病原体检测、基因表达谱分析、SNP分型及多指标筛查等领域得到广泛应用。

赛默飞QuantStudio 5荧光定量PCR仪凭借其先进的多通道光学系统、高分辨滤光技术与智能分析算法，具备强大的多重检测能力，可在单个反应中稳定区分多达5种荧光信号，实现多个基因或样本的同步检测与分析。

二、QuantStudio 5多重检测技术原理

1. 光学系统基础

QuantStudio 5采用高性能LED激发光源与冷却型CCD检测器的组合。系统通过多波段激发与多层滤光分离，实现多种荧光染料的独立检测。

• 激发源：宽谱LED阵列，可覆盖400–700 nm范围；

• 检测器：高灵敏度CCD，可同时采集五个通道信号；

• 滤光模块：专用光谱分离器与干涉滤光片，实现荧光信号高分辨检测。

该设计有效避免通道间信号串扰，使多重检测的荧光识别具有高精度与低噪声。

2. 多重检测原理

在多重体系中，每个靶标基因使用不同荧光标记探针（或染料），例如：

• FAM通道 → 靶标A

• VIC通道 → 靶标B

• ROX通道 → 靶标C

• Cy5通道 → 靶标D

QuantStudio 5通过光学滤波器分别检测不同波长的发射光信号，并实时记录荧光变化，从而同步获得多个靶标的扩增曲线。

3. 光谱解混（Spectral Deconvolution）

多重检测中，不同染料光谱可能重叠。QuantStudio 5采用光谱解混算法，将每个检测通道的复合信号分离为独立荧光分量。
算法利用预设的染料光谱校准文件（Spectral Calibration File）进行矩阵求解，计算出各染料真实信号强度，实现高精度的多通道区分。

三、QuantStudio 5多重检测系统配置

1. 通道与染料对应表

QuantStudio 5最多可实现五通道并行检测，每个通道均可独立采集荧光信号并在软件中单独分析。

2. 光谱校准要求

在进行多重检测前需执行光谱校准，以建立染料的标准光谱模板。
校准步骤：

1. 使用官方校准板（Spectral Calibration Plate）；

2. 选择所用荧光染料；

3. 系统自动采集光谱并生成校准文件；

4. 校准数据保存后即可长期使用。

四、多重检测实验设计原则

多重qPCR实验设计的核心在于体系兼容性、引物特异性与探针光谱匹配。

1. 引物与探针设计

• 每个靶标需使用特异性引物与探针组合；

• 引物长度18–25 bp，GC含量40–60%；

• 探针长度18–30 bp，Tm值较引物高5–10°C；

• 避免互补结构与二聚体形成；

• 确保不同引物间无交叉反应。

2. 荧光染料选择

染料应满足以下条件：

• 光谱间隔大，重叠小；

• 信号强度平衡；

• 与仪器通道兼容。

推荐组合：FAM + VIC + ROX + Cy5。

3. 探针与通道配置

每个探针的报告染料应分配至不同通道，淬灭剂可使用BHQ1、BHQ2或TAMRA以提高信号对比度。

4. 扩增体系配比

为避免竞争扩增，推荐体系优化如下（20 μL体系）：

五、多重检测的热循环程序

QuantStudio 5为多重检测提供专用循环模式，兼顾多靶标的扩增效率。

典型程序如下：

• 初始变性：95°C 10 min

• 循环阶段（40次）：

• 95°C 15 s

• 60°C 1 min（荧光采集）

可根据探针Tm值微调退火温度（±2°C）。
若靶标间Tm差异较大，可采用两步法程序。

六、软件操作与通道配置步骤

1. 建立实验文件

打开QuantStudio Design & Analysis Software，选择“New Experiment”，在“Experiment Type”中选取“Standard Curve”或“Quantification”。

2. 定义靶标与通道

在“Plate Setup”界面：

• 点击“Add Target”；

• 输入靶标名称；

• 选择对应报告染料与通道（如FAM、VIC、ROX、Cy5等）；

• 为每个样品分配对应靶标。

3. 设置采集模式

在“Data Collection”选项中勾选所有使用通道，并确保采集阶段选择“Anneal/Extend”。

4. 运行与采集

加载样品后点击“Start Run”，仪器将在每循环采集全部通道信号，并自动区分数据。

七、数据分析与结果判读

QuantStudio 5分析软件可同时显示多个通道的扩增曲线与结果表格。

1. 扩增曲线

每个靶标独立显示曲线（颜色区分通道）。系统自动计算基线与阈值，生成各靶标的Ct值。

2. 结果表格

报告包含以下内容：

• 样品名称；

• 通道与靶标；

• Ct值；

• ΔRn曲线幅度；

• 扩增效率；

• 是否检测阳性。

3. 多重定量分析

在“Analysis Type”中选择“Quantification”模式，系统将自动建立各靶标的标准曲线并输出拷贝数结果。

4. 颜色聚类图

若为基因分型实验，软件会绘制通道间的二维散点图，用以区分不同等位基因。

八、多重检测实验优化策略

多重体系的优化重点在于通道间平衡与扩增兼容性。

1. 优化步骤

1. 先单靶标验证各引物与探针的效率；

2. 检查扩增效率是否接近100%；

3. 在多重体系中逐步加入第二、第三靶标；

4. 若出现竞争扩增，降低高效靶标引物浓度；

5. 观察Ct值变化，确保各靶标差异<0.5。

2. 通道平衡调节

不同染料信号强度不同，系统可通过“Normalization”模块自动调整荧光增益。
若FAM信号过强而Cy5信号弱，可适当提高Cy5探针浓度或调整光学校准参数。

3. 抑制竞争效应

模板量过高或扩增效率差异大可能造成靶标竞争。
解决方法：

• 降低模板总量；

• 优化Mg²⁺浓度；

• 平衡各引物浓度。

4. 信号交叉干扰控制

确保荧光染料组合具有良好光谱分离度，并定期执行光学校准。

九、常见问题与解决方案

十、应用领域

1. 病原体联合检测

可在单管中检测多种病毒或细菌，如流感A/B、RSV、腺病毒等，缩短检测周期并节省样品。

2. 肿瘤标志物多基因检测

在肿瘤分子诊断中，通过多重qPCR同时检测多个突变位点（如EGFR、KRAS）。

3. 基因表达谱研究

可同步检测多个功能相关基因的表达水平，提高实验通量。

4. 食品安全与环境监测

实现多种污染物或致病菌的并行检测，提升筛查效率。

十一、性能优势

1. 高灵敏度与准确性
   光谱解混算法确保不同通道信号无交叉干扰。

2. 五通道并行检测
   实现单反应检测多达五个靶标，提升通量。

3. 自动数据分析
   软件可自动分通道计算Ct值、绘制标准曲线并生成报告。

4. 兼容多体系
   支持SYBR Green、TaqMan及Custom Probe体系。

5. 高重复性
   通道间Ct值标准差通常小于0.3，保证结果一致性。

十二、质量控制与验证

1. 校准验证

• 定期进行光学校准与温控校准；

• 确认通道信号强度一致。

2. 阴阳性对照

每个实验应包含：

• NTC（无模板对照）；

• 阳性对照；

• 内参控制。

3. 数据一致性检测

分析重复样本间Ct差异，标准差≤0.3为合格。

4. 软件版本同步

使用最新版本软件以获取最佳光谱分离算法。

十三、实验数据展示与报告

QuantStudio 5软件支持多重检测数据的可视化展示与自动报告生成。

报告内容包括：

• 各通道扩增曲线；

• 多靶标Ct表格；

• 相对表达分析（ΔΔCt）；

• 基因分型聚类图；

• 实验摘要、仪器编号与操作者信息。

报告可导出为PDF、Excel或图像格式，用于科研发表或临床审核。

十四、优化实例

在一次四重检测实验中，研究者同时检测四种病原体：

• FAM通道：Influenza A

• VIC通道：Influenza B

• ROX通道：RSV

• Cy5通道：Adenovirus

通过逐步优化引物浓度和平衡光谱响应，最终各靶标扩增效率95–105%，Ct差异小于0.4，重复性优异。
该结果充分验证了QuantStudio 5的多通道检测稳定性与高通量特性。