一、概述

基线调整（Baseline Adjustment）是QuantStudio 5实时荧光定量PCR数据分析中的关键步骤之一，用于剔除非特异性荧光背景信号，准确识别扩增反应的指数增长阶段，从而精确计算循环阈值（Ct值）。

在实时PCR反应的前几个循环中，荧光信号主要来自体系中的背景噪声、未结合探针、缓冲液组分和非特异产物，而非目标扩增产物。通过建立并调整基线范围，可以去除这些背景信号，获得代表真实扩增的荧光变化曲线。

QuantStudio 5系统具备自动与手动两种基线调整方式，其算法通过分析每个孔在早期循环中的荧光稳定区间，计算出平均背景信号并扣除，从而获得净荧光值（ΔRn）。合理的基线调整可显著提高扩增曲线的平滑性与准确性，是定量分析可靠性的基础。

二、基线的定义与作用

1. 基线定义

基线是PCR反应初始阶段荧光信号的平均值或趋势线，代表无特异扩增时的背景荧光水平。

QuantStudio 5软件利用该基线数据作为参考，在后续循环中计算荧光增量：

$$\Delta Rn=Rn-基线Rn$$

其中，Rn为某循环的原始荧光强度，ΔRn表示相对荧光变化量。

2. 基线的作用

• 消除非特异信号：去除荧光染料背景与仪器噪声。

• 稳定扩增曲线：使指数阶段的信号变化更清晰。

• 提高Ct值准确性：确保阈值线与曲线交点正确定位。

• 辅助判断反应异常：异常基线可反映体系污染或管差。

三、基线信号的来源

1. 光学系统背景：由荧光探测器噪声与滤光片泄漏引起。

2. 反应体系本底：包括自由探针、SYBR染料、酶和缓冲液。

3. 物理效应：光散射、气泡、封膜厚度差异等。

4. 温度波动：循环初期温度变化导致光学漂移。

QuantStudio 5通过多点取样与曲线拟合自动区分这些噪声成分，以确保真实信号检测。

四、QuantStudio 5自动基线算法原理

系统默认采用“Adaptive Baseline Algorithm”（自适应基线算法）。

1. 计算流程

1. 选取前3–15个循环作为候选区间；

2. 计算每循环的荧光信号平均值与方差；

3. 识别信号稳定的区段（方差最小、均值变化平缓）；

4. 建立回归拟合曲线，定义该区段的平均信号为基线；

5. 对后续循环逐点执行ΔRn计算。

2. 判断标准

• 荧光信号在候选区间内波动系数（CV）< 2%；

• 基线增长趋势斜率接近0（<0.005）；

• 无显著荧光漂移。

若某孔信号偏离此规律，软件会自动调整基线区间。

3. 动态修正机制

QuantStudio 5可在分析阶段实时更新基线范围。当扩增曲线存在迟滞或早期波动时，系统会自动延长或缩短基线窗口，以获得最佳背景校正。

五、手动基线调整操作步骤

在特定情况下（如低浓度模板或非典型曲线），自动算法可能不完全适用，需人工干预调整。

1. 打开分析界面

在QuantStudio Design & Analysis Software中，选择：
Analysis → Amplification Plot → Baseline Settings。

2. 查看自动计算区间

系统默认显示基线起止循环（如Cycle 3–15）。

3. 手动调整范围

• 点击“Manual”模式；

• 拖动图上标尺或输入具体循环数；

• 观察曲线平滑程度与指数期起点。

4. 调整原则

• 起点应位于荧光信号刚开始稳定的位置；

• 终点应在曲线进入指数增长前1–2个循环；

• 若基线过短，可能残留噪声；

• 若基线过长，会削弱真实信号。

5. 验证效果

基线调整后，应确保ΔRn曲线在指数期起点平滑上升，无突跳或下降。

6. 保存设置

调整完成后点击“Apply to All”或“Apply to Selected Wells”，以统一应用至整个板或部分孔。

六、不同检测模式下的基线差异

1. SYBR Green模式

该模式荧光信号随双链DNA增加而上升。基线应设置在扩增曲线明显上升前（通常Cycle 3–15）。

2. TaqMan探针模式

探针裂解后释放报告荧光，信号增长较平缓。推荐基线范围Cycle 5–18。

3. 多重检测模式

每个荧光通道独立设置基线。不同染料发光强度不同，系统自动区分并分别调整。

4. 熔解曲线模式

不使用标准基线算法，而采用信号归一化处理，不需调整基线区间。

七、基线调整的数学逻辑

QuantStudio 5的基线计算基于信号拟合模型：

Rni=a+b×i+εiRn_i = a + b \times i + ε_iRni=a+b×i+εi

其中，a为初始荧光背景，b为漂移系数，ε为噪声项。
系统通过最小二乘法估计a和b，并以该回归结果扣除原始信号，得到真实ΔRn曲线：

ΔRni=Rni−(a+b×i)ΔRn_i = Rn_i - (a + b \times i)ΔRni=Rni−(a+b×i)

此方法能有效消除线性漂移型背景噪声。

八、基线与阈值（Threshold）的关系

基线调整完成后，系统自动生成阈值线，用于计算Ct值。
阈值线的设定基于ΔRn曲线在指数期内的稳定区域。

若基线过高，ΔRn值过小，Ct值将偏高；
若基线过低，ΔRn值被高估，Ct值偏低。

因此，基线调整直接决定Ct计算的精度，是定量分析的前提条件。

九、基线调整的优化策略

1. 提前规划

在实验设计阶段，应保证信号质量优良、噪声低，以减少后续调整量。

2. 合理设置基线窗口

通常Cycle 3–15为推荐范围，但不同模板量可适当延长或缩短。

3. 同组样品统一基线

保持同组孔位采用相同基线区间，避免Ct偏差。

4. 比较曲线一致性

若同一样品重复孔曲线重合度差，应重新分析基线。

5. 保留原始数据

在调整前保存原始分析文件，以便回溯与比较。

6. 结合标准曲线验证

基线调整后应重新计算扩增效率与R²，确保效率保持在90–110%。

十、常见问题与解决方案

十一、基线调整的质量判断标准

1. 曲线平滑性：基线段内无突跳或噪声。

2. 指数期特征明显：ΔRn曲线呈典型“S”型。

3. 重复孔一致性：Ct标准差≤0.3。

4. 信号强度合理：荧光峰值稳定，未饱和。

5. 标准曲线线性好：R²≥0.99，斜率介于−3.1至−3.6。

满足以上条件说明基线调整有效。

十二、不同实验类型下的应用

1. 绝对定量分析

基线稳定性直接影响标准曲线拟合质量，应确保各标准样基线一致。

2. 相对定量分析

内参与目标基因应使用相同基线区间，避免ΔΔCt偏差。

3. 病原体检测

低模板反应需延长基线（如Cycle 5–20），以避免早期噪声误判阳性。

4. 高通量筛查

批量分析时，建议启用自动基线算法并统一审查可疑曲线。

十三、数据保存与记录

QuantStudio软件会在分析文件（.eds）中保存以下基线信息：

• 自动或手动模式标记；

• 每个孔的基线起止循环；

• ΔRn计算结果；

• 操作者与时间戳。

这些信息在实验报告中会被自动引用，形成可追溯记录，符合实验室信息管理系统（LIMS）要求。

十四、基线调整与仪器校准的关系

QuantStudio 5的光学系统需定期进行光谱校准（Spectral Calibration）与亮度均衡，以保证基线数据准确。
若光学校准异常，基线信号将出现系统性漂移。
建议每6个月执行一次校准程序，并在报告中记录结果。

十五、优化示例

以SYBR Green体系为例：

• 初始自动基线设置Cycle 3–15，曲线出现早期上升；

• 手动延长至Cycle 3–17后，曲线平滑，Ct差异减小0.4；

• ΔRn曲线呈完美“S”形，标准曲线R²由0.985提升至0.999。

该实例表明，恰当的基线调整可显著提升定量精度。