赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5反应体系配置

反应体系配置（Reaction System Setup）是实时荧光定量PCR（qPCR）实验的核心环节之一，其科学性和精确度直接决定扩增效率、灵敏度、特异性以及重复性。对于赛默飞QuantStudio 5荧光定量PCR仪而言，合理的反应体系不仅可充分发挥仪器的光学与温控性能，还能保障数据稳定、信号强度充分和Ct值准确。

产品详细

一、概述

QuantStudio 5兼容多种荧光检测模式，包括SYBR Green、TaqMan探针、HRM（高分辨熔解曲线）等，每种模式对体系组成都有不同要求。理解反应体系的设计原则、各组分作用以及比例优化方法，是确保实验结果可靠的关键前提。

二、反应体系设计的基本原则

特异性优先原则
体系设计应优先保证引物和探针的特异性，避免非特异性扩增。
体系平衡原则
各组分浓度需在最佳范围内协同作用，避免因Mg²⁺、dNTP或酶浓度不均造成扩增偏差。
灵敏性与稳定性兼顾
体系应兼顾高灵敏度检测与长期反应稳定性，使荧光信号在指数阶段准确反映模板变化。
兼容仪器特性
QuantStudio 5具有快速温控与高光学灵敏度特征，因此反应体系宜采用快速反应体系配方。

三、QuantStudio 5常用反应体系类型

根据实验类型与检测方式不同，QuantStudio 5反应体系主要分为两大类：

实验类型	检测原理	推荐体系类型	荧光染料
基因表达定量	荧光染料与双链DNA结合	SYBR Green体系	SYBR Green I
基因突变检测 / 病原体检测	荧光探针特异结合	TaqMan探针体系	FAM / VIC / ROX / Cy5 等

两种体系在配置比例、扩增曲线形态及结果分析算法上有所差异。

四、SYBR Green体系配置

1. 体系组成（20 μL反应体系为例）

组分	浓度	体积（μL）	作用说明
2× SYBR Green Master Mix	1×最终浓度	10.0	含缓冲液、MgCl₂、dNTP、Taq酶与染料
上游引物	10 μM	0.4	特异识别模板序列
下游引物	10 μM	0.4	配合上游引物完成扩增
模板DNA	1–100 ng/μL	1.0–2.0	扩增靶序列来源
无核酸水	—	补足至20 μL	维持体系总体积

2. 配制方法

所有组分应置于冰上操作；
先混合Master Mix与引物，再加入模板；
轻轻吹打混匀，不可剧烈振荡；
离心瞬时收集液体，防止气泡影响光学检测。

3. 注意事项

避免模板过量，否则会导致非特异性扩增；
若出现引物二聚体，应优化引物设计或调整退火温度；
使用ROX作为被动参照染料以校正荧光波动。

五、TaqMan探针体系配置

1. 体系组成（20 μL反应体系为例）

组分	浓度	体积（μL）	说明
2× TaqMan Universal Master Mix	1×最终浓度	10.0	含Taq酶、MgCl₂、dNTP与缓冲液
上游引物	10 μM	0.4	靶序列识别
下游引物	10 μM	0.4	协同扩增
TaqMan探针	10 μM	0.2	FAM/VIC标记，检测荧光信号
模板DNA / cDNA	1–100 ng/μL	1.0–2.0	目标序列来源
无核酸水	—	补足至20 μL	维持体系体积

2. 探针设计要点

探针应位于引物之间，长度18–30 bp；
报告染料与淬灭剂匹配（如FAM–BHQ1）；
Tm值比引物高5–10°C；
避免连续G碱基与二级结构。

3. 通道分配与染料选择

QuantStudio 5支持五通道检测，不同探针可分配至不同通道以实现多重检测。

通道	染料	常用用途
Channel 1	FAM	主要目标基因
Channel 2	VIC / HEX	内参基因
Channel 3	ROX	参照染料
Channel 4	Cy5	病毒或突变检测
Channel 5	TAMRA	备用染料通道

六、反应体系比例优化

1. 模板浓度优化

模板过多会导致荧光基线抬高、非特异性产物增加；模板过少则Ct值偏高。
推荐模板浓度范围：

基因组DNA：10–100 ng/μL；
cDNA：1–50 ng/μL；
病原体RNA：1–10³拷贝/μL。

2. 引物浓度优化

一般范围0.1–0.5 μM。
引物过高会产生二聚体，过低则信号弱。
建议通过梯度实验（0.1、0.2、0.3、0.4 μM）确定最佳浓度。

3. Mg²⁺浓度调整

Mg²⁺是PCR反应的关键因子，通常体系中最终浓度为3–5 mM。
过高会降低特异性，过低会导致扩增效率低。

4. 探针浓度调整

探针浓度建议为0.1–0.25 μM，确保荧光信号清晰且不影响反应速率。

5. 扩增效率评估

通过标准曲线计算效率：

$(10^{-1/slope} - 1) \times 100\%$

理想扩增效率在90–110%之间。

七、反应体系准备与分装流程

准备工作区
在洁净区域内操作，避免交叉污染；使用滤芯吸头。
母液混合
先制备母液（Master Mix），再根据样品数分装；母液组成应一致。
样品加载
按板布局表逐孔加样，注意标记位置。
封板与离心
使用光学封板膜密封，防止蒸发；短暂离心收集液体。
转移至仪器
将反应板放入QuantStudio 5热循环模块中，对准定位标识。

八、常见体系问题及调整策略

现象	可能原因	调整措施
Ct值不稳定	样品混匀不足或气泡	离心收集液体，重新混匀
扩增曲线异常	阈值设定或模板污染	重新分析或更换样品
双峰熔解曲线	非特异性扩增或引物二聚体	优化退火温度或重新设计引物
扩增效率<90%	Mg²⁺不足或模板过少	增加Mg²⁺浓度或模板量
背景信号高	探针降解或染料漂移	更换探针并进行光学校准
扩增过早（Ct偏低）	污染导致假阳性	检查NTC孔与加样区洁净度

九、QuantStudio 5系统参数与体系匹配

QuantStudio 5的热循环参数与体系成分紧密相关。
推荐程序如下：

1. SYBR Green模式

初始变性：95°C 2 min
循环阶段（40次）：95°C 15 s → 60°C 30 s（荧光采集）
熔解曲线：60–95°C，每0.3°C/s

2. TaqMan模式

初始变性：95°C 10 min
循环阶段（40次）：95°C 15 s → 60°C 1 min（荧光采集）

系统会根据所选体系自动调节上盖温度（推荐105°C）与采集时间。

十、反应体系稳定性与保存

1. 体系保存条件

Master Mix未混合模板前可于−20°C保存6个月；
混合体系（含模板）应即时使用，避免降解；
若短时存放，可置于4°C不超过24小时。

2. 反复冻融控制

酶和染料对冻融敏感，建议不超过3次冻融循环；可分装小体积保存。

3. 光照保护

SYBR染料和TaqMan探针对光敏感，应避光操作与保存。

十一、多重检测体系配置

QuantStudio 5支持多靶标同时检测，多重体系配置需确保反应平衡。

1. 多重体系设计要点

不同探针使用光谱分离良好的染料；
各引物浓度根据扩增效率调整（可略低于单重实验）；
确保扩增曲线无通道干扰。

2. 多重体系示例（20 μL）

组分	体积（μL）	说明
2× TaqMan Multiplex Master Mix	10.0	多通道优化体系
上下游引物（靶标1）	各0.3	FAM通道
探针（靶标1）	0.2	FAM标记
上下游引物（靶标2）	各0.3	VIC通道
探针（靶标2）	0.2	VIC标记
模板	1.5	混合DNA
无核酸水	余量至20 μL	—

十二、内参体系配置

在相对定量实验中，需同步检测目标基因与内参基因（如GAPDH、ACTB）。

1. 配置策略

内参与目标基因分配至不同通道（如目标FAM，内参VIC）；
体系中应保持相同总量；
确保内参Ct值稳定且重复性好。

2. 内参标准要求

内参基因应在所有样品中表达恒定，不受实验处理影响。

十三、反应体系质量控制

NTC（无模板对照）：用于检测污染，应无信号或Ct>40。
阳性对照：验证体系有效性。
重复性测试：每组样品设2–3个技术重复孔。
标准曲线校验：定期验证扩增效率与线性度。
仪器校准同步：反应体系优化需配合光学校准与温控校正。

十四、体系优化实例

在基因表达实验中，通过调整反应体系可显著改善信号质量。

优化前：Ct值波动大，曲线不对称；
优化后：调整引物浓度至0.25 μM、模板量5 ng，曲线平滑且Ct差异<0.3。

优化经验显示，反应体系配比的微调往往比硬件条件更能提高实验精度。

十五、实验记录与模板化管理

1. 建立体系模板

在QuantStudio软件中，可将反应体系配置参数保存为模板（.rct文件），便于重复实验调用。

2. 实验记录表内容

样品编号
模板浓度
体系组成与批号
操作者与时间
反应板号与孔位布局

所有记录应与实验报告一并归档。

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