一、概述

样品布局（Sample/Plate Setup）是赛默飞QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪实验配置的核心环节之一。它决定了PCR板上每个孔的样品类型、检测靶标、荧光通道及对应的分析逻辑，是实现数据采集、曲线绘制和结果计算的基础。

QuantStudio 5软件提供直观的图形化板布局界面，用户可通过简单的点击与拖拽操作完成样品、目标基因、对照及通道的分配。正确的布局设置不仅保证扩增曲线和Ct值计算准确，还可提升实验效率和数据的可重复性。

二、样品布局的重要性

1. 实验设计的逻辑核心

样品布局是PCR实验“信息化表达”的形式。仪器通过布局文件识别每个孔的属性，从而在分析阶段自动区分目标样本、阴性对照、标准样和内参。

2. 数据分析的前提条件

布局定义直接影响分析算法执行：

• 决定荧光信号与目标基因对应关系；

• 影响阈值计算与Ct提取；

• 决定标准曲线分组与定量模型；

• 决定相对定量中ΔΔCt计算的参照。

3. 重复性与可追溯性保障

科学的布局可实现批次间一致性，便于后续分析复现与质量追踪。

三、布局设置界面简介

QuantStudio 5的软件系统将样品布局集成于“Setup”模块中的 Plate Setup 界面，分为以下部分：

1. 板视图（Plate View）：显示96孔或384孔反应板的孔位矩阵。

2. 属性面板（Properties Panel）：右侧用于编辑每个孔的样品名称、靶标、通道等属性。

3. 工具栏（Toolbar）：包括“Add Sample”、“Add Target”、“Assign”、“Clear”等命令按钮。

4. 分组视图（Grouping View）：支持按样品或靶标查看布局。

5. 预览窗口（Preview）：显示孔位属性的颜色编码（如样品类型、通道分布）。

该界面设计清晰，便于直观查看板上配置情况。

四、布局设置的基本流程

1. 选择板型

根据实验需求选择合适板型：

• 96-Well Block：标准通量，适合常规分析；

• 384-Well Block：高通量检测；

• Fast Block：适用于快速反应体系。
  选择板型后系统自动匹配对应温控与光学参数。

2. 添加样品（Sample）

在“Sample”栏点击“Add New Sample”，输入样品名称，如 Sample_1、Control_1、NTC 等。
支持以下类型：

• Unknown（未知样品）

• Standard（标准曲线样）

• NTC（无模板对照）

• Negative Control（阴性对照）

• Positive Control（阳性对照）

可批量输入多个样品名，或从Excel导入样品列表。

3. 添加靶标（Target）

点击“Add Target”定义检测基因或序列名称，如：

• Target_1：目的基因（如 GAPDH, β-actin）；

• Target_2：参考或对照基因；

• Probe 通道分配：FAM、VIC、ROX、CY5等。
  每个靶标需设定荧光通道和报告染料。

4. 样品与靶标匹配

在板视图中选中相应孔位，选择“Assign Target”命令，将样品与靶标对应。
若为多重检测实验，每个样品可对应多个靶标与不同通道。

5. 定义孔属性

为每个孔设置：

• Sample Type（样品类型）：Unknown、Standard、NTC等；

• Reporter Dye（报告染料）：FAM/VIC/ROX/Cy5；

• Quencher（淬灭剂）：BHQ1、TAMRA等；

• Passive Reference（内参染料）：ROX；

• Replicates（重复孔数）：2–3个孔，确保统计可靠性。

系统通过颜色区分不同类型孔位，如蓝色代表标准样，灰色代表对照。

6. 设置标准曲线

若进行绝对定量分析，需在“Standards”部分定义梯度浓度。
输入每个标准样的拷贝数或浓度值（如10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³）。
系统自动生成标准曲线用于计算未知样的定量结果。

7. 布局检查

设置完成后使用“Validate Plate Setup”命令，系统自动检查是否存在未分配样品或缺失靶标孔。
所有孔位信息通过验证后，点击“Save Setup”。

五、布局设置的逻辑结构

QuantStudio 5的软件在样品布局设计中采用分层逻辑管理模型。

1. 层级结构

• Experiment Level（实验层）：整体实验类型与目的。

• Target Level（靶标层）：定义检测的基因与通道。

• Sample Level（样品层）：定义每个孔的样品名称与类型。

• Well Level（孔层）：最终属性组合体，表示一个独立的反应单元。

2. 数据关系

一个样品可包含多个靶标，一个靶标可对应多个样品。系统自动生成组合矩阵，实现数据的全面映射。

3. 显示模式

可通过“By Sample”或“By Target”切换显示：

• “By Sample”：查看单一样品在不同通道下的检测情况；

• “By Target”：查看某一靶标在所有样品中的分布。

六、样品分组与命名规范

1. 命名建议

• 样品名应包含实验批次信息，如 “S1_2025_10_26”；

• 对照样命名统一，如“NTC_1”“STD_10E5”；

• 不使用空格和特殊字符，避免数据导出错误。

2. 分组原则

样品可按实验设计逻辑进行分组：

• 生物学分组：如Treatment vs Control；

• 技术重复分组：同一样品的多孔重复；

• 标准梯度分组：用于标准曲线绘制；

• 多基因检测分组：每个靶标为一组。

软件支持在分组后自动计算组内平均Ct值及标准差。

七、多重荧光检测布局

QuantStudio 5具备多通道光学检测系统，可同时检测多种荧光信号。
在样品布局中，应根据染料光谱特性合理配置通道：

多重体系中应避免光谱重叠，必要时进行光学校正（Spectral Calibration）。

八、内参与对照布局

1. 内参基因孔位

内参基因用于相对定量归一化，应在同一板上与目标基因同步检测。
布局建议：

• 内参与目标基因交叉分布；

• 每组样品至少两个重复孔；

• 使用不同通道区分（如目标FAM，内参VIC）。

2. 对照孔设置

• NTC（No Template Control）：检测污染；

• Positive Control：验证体系可靠性；

• Standard Sample：建立标准曲线。

系统会在分析阶段自动识别这些孔并排除异常Ct。

九、模板导入与批量编辑

1. 模板导入

用户可将常用板布局保存为模板文件（.plt），以便后续直接加载。
导入方法：

• 选择“Import Setup” → 选择模板文件 → 系统自动载入样品与靶标信息。

2. 批量编辑

QuantStudio 5支持复制、粘贴与批量赋值操作。
例如：

• 选中A1–A3，右键选择“Assign Sample → Sample_1”；

• 系统自动填充孔属性。

此功能大大提升实验配置效率，适合高通量实验。

十、样品布局与数据分析的对应关系

样品布局不仅定义实验结构，还直接影响后续分析：

1. 定量分析（Quantification）：根据标准曲线自动匹配样品组；

2. 相对定量（ΔΔCt）：系统根据样品与内参关系计算倍数变化；

3. 熔解曲线分析（Melt Curve）：布局定义每个通道的分析范围；

4. 基因分型（Genotyping）：布局决定通道分布与聚类计算逻辑。

错误布局可能导致分析结果偏差或Ct值缺失，因此在运行实验前应再次验证配置正确性。

十一、样品布局优化策略

1. 提高数据一致性

• 同组样品应邻近放置，减少温控差异；

• 避免不同组孔位交错分布；

• 对称布局可减小模块边缘效应。

2. 提升信号稳定性

• 标准样应分布在不同区域以验证均匀性；

• 内参孔应分布在整板中间位置，避免边缘温漂影响。

3. 多重实验设计技巧

• 通道配置应符合染料兼容性；

• 确保每种染料至少有一个标准孔用于信号校正；

• 对多靶标实验，建议以列为单位区分靶标，以行区分样品。

4. 数据追溯管理

为每个布局文件添加注释，包括实验日期、操作者、引物批次、样品编号，确保可追溯性。

十二、常见错误与解决方案

十三、质量控制与校验

1. 系统自检

布局完成后运行“Validation Tool”，系统自动检查：

• 是否有未分配孔；

• 样品类型设置是否合理；

• 通道是否匹配染料类型。

2. 人工复核

操作员应对照实验设计表逐项核查孔位配置。

3. 模拟运行

可使用“Preview Run”功能查看运行过程模拟，确保荧光采集阶段与通道一致。