一、概述

检测灵敏度是衡量实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，qPCR）仪性能的重要指标之一。它反映了仪器对极低拷贝数核酸模板的检测能力，即在保持扩增特异性和准确性的前提下，设备能可靠区分荧光信号与背景噪声的最小反应水平。

赛默飞（Thermo Fisher Scientific）QuantStudio 5荧光定量PCR仪在灵敏度方面表现优异，凭借其高精度光学检测系统、稳定的热循环控制技术及智能算法支持，能够检测低至1个拷贝模板的DNA或RNA目标分子。这一性能使其广泛应用于分子诊断、基因表达分析、微量病原检测、基因分型及精准医疗等领域。

二、检测灵敏度的基本原理

1. 灵敏度定义

在qPCR实验中，检测灵敏度通常定义为系统能准确检测到的最低模板浓度或拷贝数，并在统计学意义上区分阳性样本与阴性对照的能力。

灵敏度不仅取决于仪器的光学性能，还受到反应体系、样品纯度和算法判读等多方面影响。

2. 原理机制

QuantStudio 5通过实时监测荧光信号的累积变化来反映扩增反应的进行。当荧光信号强度超过设定阈值时，系统记录对应循环数为Ct值。
仪器检测灵敏度的高低取决于：

• 荧光采集系统能否识别极微弱信号；

• 背景噪声抑制效果；

• 温控均匀性是否保证反应一致性；

• 算法能否准确提取真实信号而非噪声。

三、QuantStudio 5检测灵敏度的技术支撑

QuantStudio 5的高灵敏度来自其在光学、温控、算法三方面的综合优化。

1. 光学检测系统

（1）光源与激发系统

仪器采用高功率LED光源，提供稳定、宽谱且低漂移的激发光。其亮度稳定性误差低于0.1%，保证微弱信号在早期循环中即可被识别。

（2）多通道光学滤光设计

系统配备独立光路通道和高选择性滤光片组，确保各荧光染料（FAM、VIC、ROX、Cy5等）信号互不干扰。
这种多光路结构可在低浓度样品检测中有效避免信号重叠。

（3）高灵敏CCD检测器

QuantStudio 5采用高分辨率冷却型CCD（Charge-Coupled Device）检测芯片，其暗电流噪声极低，可捕获微弱荧光信号变化。信噪比（SNR）达到1000:1以上，为灵敏度检测提供了硬件保障。

2. 温度控制系统

灵敏的检测依赖于高度一致的扩增反应。QuantStudio 5温控系统采用多区独立控温技术（Peltier效应），确保每孔温度差异小于±0.3°C。
这种精确控温使得即便是单拷贝模板也能在早期循环中被稳定扩增，从而显著提升检测灵敏度与可重复性。

3. 智能信号处理算法

QuantStudio 5软件内置自适应基线校正与动态阈值算法。

• 自动识别基线范围，剔除背景噪声；

• 根据指数增长特征自适应设定阈值；

• 对异常波动信号进行平滑拟合与异常点剔除。

算法优化使得低拷贝信号的Ct值计算更加稳定，减少人为设置造成的偏差。

四、检测灵敏度性能指标

赛默飞官方验证数据显示，QuantStudio 5在标准实验条件下具备以下性能：

通过严格的标准曲线测试，其Ct值与模板浓度的对数关系线性度极高，证明系统在宽浓度范围内均具备出色灵敏度与可靠性。

五、影响检测灵敏度的因素

虽然仪器本身具备高灵敏度，但实验条件及操作环节也会显著影响检测下限。

1. 样品质量

核酸模板的完整性与纯度直接决定扩增效率。

• 过多的抑制物（如酚、乙醇、盐离子）会降低信号强度；

• 模板降解会导致Ct值漂移。
  建议使用高质量提取试剂盒，并检测A260/A280比值在1.8–2.0之间。

2. 引物与探针设计

引物特异性和熔解温度（Tm）差异不合理会产生非特异性扩增。

• 引物长度建议18–25 bp；

• GC含量保持在40–60%；

• 尽量避免二聚体结构。

3. 反应体系优化

适宜的酶、离子与缓冲体系浓度是灵敏检测的前提。
QuantStudio推荐使用PowerUp SYBR Green Master Mix或TaqMan Fast Advanced Master Mix，可在低模板浓度下保持高扩增效率。

4. 操作规范性

气泡、蒸发、加样误差均可能导致信号不稳定。

• 加样应均匀，避免交叉污染；

• 反应板需密封严实，避免冷凝；

• 各孔体积一致。

5. 光学校准状态

仪器若长时间未进行通道校准，可能影响荧光检测灵敏度。建议每6个月执行一次光学校准（Optical Calibration）以保证信号强度准确性。

六、灵敏度验证与实验方法

1. 标准曲线验证法

（1）实验目的

验证仪器在不同模板浓度下的检测能力与线性范围。

（2）方法步骤

1. 准备目标DNA的10倍系列稀释液（10⁸–10¹ copies/μL）；

2. 分别进行qPCR扩增，每个浓度设置3个重复孔；

3. 记录Ct值，绘制Ct–log(拷贝数)标准曲线；

4. 计算线性相关系数R²与扩增效率E。

（3）判断标准

• R² ≥ 0.99；

• 扩增效率90–110%；

• 最低浓度样品仍能显示典型“S”型曲线。

2. 阈值法验证

通过调整阈值线观察低浓度模板的曲线交叉点是否稳定。若Ct波动≤0.5且重复性良好，则说明灵敏度可靠。

3. 稀释梯度重复检测

以低拷贝标准样（如5 copies）进行10次重复实验。若检测阳性率≥95%，可认定检测下限为5 copies。

七、不同检测模式下的灵敏度表现

QuantStudio 5支持SYBR Green与TaqMan两种检测体系，在灵敏度上各具优势。

1. SYBR Green模式

适用于基因表达分析和一般定量研究。
灵敏度通常可达10 copies/μL。
优点：操作简便、成本低；
缺点：非特异性产物可能影响最低检测限。

2. TaqMan探针模式

通过荧光探针特异性识别靶序列，有效减少背景信号干扰。
可稳定检测单拷贝模板。
在病毒检测、基因突变与SNP分析中表现突出。

八、灵敏度优化策略

1. 反应体系优化

• 模板体积：2–5 μL最佳；

• 总体系体积：20 μL；

• Mg²⁺浓度控制在3–5 mM；

• 引物终浓度：0.2 μM；

• 探针终浓度：0.1 μM。

2. 实验环境控制

• 室温稳定在20–25°C；

• 实验区分区操作，防止气溶胶污染；

• 使用带滤芯移液器吸头。

3. 使用内参与阴性对照

内参基因（如GAPDH、ACTB）可评估体系效率；
NTC（无模板对照）用于检测污染，确保灵敏度判断准确。

4. 优化阈值与基线

在软件中调整基线范围（Cycle 3–15）与阈值位置（指数期中段），可提高Ct判定的准确性。

5. 重复实验与统计分析

通过多孔重复与标准偏差计算，可评估检测稳定性。
一般要求Ct标准差≤0.3。

九、灵敏度在应用中的体现

1. 病原体检测

QuantStudio 5可在极低样本拷贝下实现病毒RNA检测，如SARS-CoV-2、HBV、HPV等。
通过多通道同步检测，可在一次反应中识别多个病原体，灵敏度优于传统PCR 100–1000倍。

2. 微量样本研究

在单细胞或低表达基因实验中，仪器仍能准确识别信号变化。
特别适用于外泌体RNA分析、稀有突变检测等高灵敏研究。

3. 临床诊断与药物筛选

灵敏度提升使得早期病变或微量病原物检测成为可能，为精准医疗提供技术基础。

十、数据分析与灵敏度评估指标

在软件的分析模块中，灵敏度可通过以下指标评估：

• Ct值差异（ΔCt）：低模板样本与阴性对照间Ct差值应>3；

• 检测阳性率：低浓度模板重复检测阳性比例≥95%；

• 标准曲线斜率：–3.32 ± 0.2 表示良好效率；

• 信噪比（SNR）：目标信号/背景噪声≥20；

• 重复性SD：Ct标准差≤0.3。

系统自动计算这些参数，并生成灵敏度验证报告。

十一、灵敏度维护与校准

为了长期保持高灵敏度，需定期进行仪器维护与校准：

1. 光学校准

• 使用官方光学标准板进行通道校正；

• 确保激发与发射波长精确匹配。

2. 温控校验

每6个月验证温控精度，确保模块温差≤0.3°C。

3. 软件更新

更新算法版本可优化低信号识别性能。

4. 实验环境监控

保持实验室洁净，避免灰尘干扰光路。

十二、QuantStudio 5灵敏度优势总结

QuantStudio 5通过软硬件一体化优化，达到了临床诊断级别的灵敏度标准，可满足科研及医疗双重需求。