赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5模板浓度校准

模板浓度校准是指通过对已知浓度的核酸模板进行扩增反应，建立模板浓度与Ct值的标准曲线，以此确定未知样品中模板的实际浓度。荧光定量PCR的检测信号与初始模板量成对数关系，理论上模板越多，Ct值越小。

产品详细

一、模板浓度校准的基本原理

数学关系表达式如下：

$\times \log(C_0) + b$

其中：

Ct 为阈值循环数；
C₀ 为模板初始浓度；
k 为线性回归斜率；
b 为截距。

通过标准曲线回归方程即可推算未知样品的模板浓度。校准过程的目的在于消除样品稀释误差、扩增体系偏差和仪器检测差异，确保Ct值与浓度呈良好线性关系（R²≥0.99）。

二、模板浓度校准的重要意义

提高定量准确性：通过标准曲线推算未知样品浓度，实现绝对定量或相对定量分析。
确保扩增效率稳定：验证PCR体系在不同模板量下的反应一致性。
监控仪器性能：通过Ct值线性分布判断光学系统与热循环模块的精度。
检测实验可重复性：浓度校准可用于评估样品前处理或稀释操作的可靠性。
优化反应体系：通过浓度梯度分析可确定模板最佳使用量范围，避免扩增抑制或非特异反应。

三、模板校准所需材料与试剂

模板类型

质粒DNA、PCR纯化产物或标准RNA；
浓度明确、纯度高（A260/A280在1.8–2.0之间）。

反应体系

QuantStudio 5配套的TaqMan或SYBR Green Master Mix；
上下游引物、探针及无核酸水。

标准稀释液

建议使用TE缓冲液或无RNA酶水；
避免使用含盐或蛋白的溶液以防影响酶活性。

实验耗材

96孔PCR反应板、光学密封膜；
微量移液器及低吸附吸头。

四、模板浓度校准实验设计

1. 稀释梯度设定

模板浓度应覆盖样品预期范围，通常采用10倍系列梯度，如：
10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² copies/μL。
每个梯度设置三重复孔以提高统计可靠性。

2. 模板储备与稀释

原始模板浓度可通过NanoDrop、Qubit或荧光染料定量获得。
稀释步骤：

将模板稀释至最高浓度标准溶液（如10⁷ copies/μL）；
使用无RNA酶水逐级10倍稀释，制备系列标准。
在每次稀释前充分混匀并更换吸头，防止交叉污染。

3. 反应体系配置

推荐体系体积：20 µL

10 µL 2× Master Mix；
0.4 µL 引物F（10 µM）；
0.4 µL 引物R（10 µM）；
1 µL 模板；
8.2 µL 无核酸水。

若使用TaqMan体系，则在体系中加入0.2 µL荧光探针（10 µM）。

4. 反应程序设置

初始变性：95℃ 2分钟；
循环阶段（40次）：95℃ 15秒，60℃ 1分钟（采集荧光信号）；
若使用SYBR体系，可加熔解曲线分析：60–95℃，升温速率0.3℃/秒。

五、QuantStudio 5软件参数设置

实验类型选择

选择“Standard Curve (Absolute Quantification)”模式；
输入实验名称与描述。

样品布局

在“Sample Setup”界面输入标准样品名称（如Std_1至Std_6）；
“Task Type”选择Standard，输入对应浓度值；
未知样品设置为“Unknown”。

荧光通道选择

SYBR体系使用FAM通道；
TaqMan体系可使用FAM、VIC或CY5等通道；
ROX作为Passive Reference参考染料用于信号归一化。

采集设置

在退火/延伸阶段采集荧光信号；
采集频率：每循环一次。

阈值与基线调整

软件自动设定基线（一般为3–15循环）；
阈值线应处于指数增长区间，避免过低或过高。

六、实验执行与信号采集

QuantStudio 5在实验运行时会实时监测荧光信号并绘制扩增曲线。

当荧光信号超过阈值时，系统记录Ct值；
实验完成后生成扩增曲线与标准曲线图；
检查阴性对照应无荧光信号，以排除污染。

七、数据分析与浓度计算

1. 标准曲线绘制

软件自动将标准样品的Ct值与其浓度对数（Log10）进行线性回归，生成标准曲线：

$\times \log(C_0) + b$

结果参数包括：

斜率 (k)：理想值–3.32（对应100%扩增效率）；
R²值：≥0.99表示线性良好；
截距 (b)：反映仪器检测灵敏度。

2. 模板浓度计算

系统根据未知样品Ct值代入标准曲线方程自动计算其浓度。
例如：
若标准曲线方程为 Ct = –3.32 × log(C₀) + 38，
未知样品Ct = 25，则浓度计算为：

$copies/μLC_0 = 10^{(38-25)/3.32} = 1.1 \times 10^4 \, copies/μL$

3. 数据导出

结果可导出为Excel、CSV或PDF格式，便于后续统计与报告撰写。

八、模板浓度校准的质量控制

扩增曲线特征

所有标准品扩增曲线应呈典型“S形”；
阴性对照无信号；
重复孔曲线应重合良好。

线性判定

R²≥0.99为合格；
若低于0.98，需检查梯度稀释或样品分配误差。

扩增效率评估

计算公式：E = (10^(-1/斜率) – 1) × 100%；
90%–110%为理想范围。

重复性检测

同一梯度的Ct标准差≤0.3；
若差异较大，需检查移液或气泡。

九、常见误差来源与对策

问题类型	可能原因	解决方法
Ct值偏高	模板浓度过低或降解	重新提取或浓缩模板
R²偏低	稀释不准确或部分梯度异常	重新制备标准梯度
扩增效率过高 (>110%)	引物二聚体或非特异扩增	优化退火温度、检查熔解曲线
扩增效率过低 (<90%)	抑制物残留或Mg²⁺不足	纯化模板或优化反应体系
曲线波动	光学窗口污染或气泡	清洁窗口并离心样品板
阴性对照出现信号	污染	更换试剂、重新操作

十、模板浓度校准优化策略

模板纯度优化

采用高纯度DNA提取试剂盒；
检查A260/A230值以评估盐或有机溶剂污染；
使用磁珠纯化可去除PCR抑制剂。

稀释精度控制

使用校准后的移液器；
每步稀释后充分混匀；
稀释倍数不宜超过10倍，以减少累积误差。

引物设计优化

确保引物Tm值差<2℃；
目标片段长度80–150 bp；
避免自互补序列。

扩增体系调整

检查Master Mix与酶活性；
调整Mg²⁺浓度和退火温度；
优化探针浓度，防止信号过强或过弱。

光学检测稳定性维护

每月进行光学校准；
保持仪器内部清洁干燥；
避免频繁开关机造成热应力。

十一、模板浓度校准的应用领域

绝对定量分析

利用标准曲线计算未知样品拷贝数；
应用于病毒载量监测、转基因定量检测等。

相对定量分析

校准目标基因与内参基因模板浓度，确保扩增效率相近。

质控与设备校验

定期进行模板浓度校准可验证仪器性能；
对不同批次试剂进行一致性测试。

标准化实验体系建立

建立长期可追溯的标准模板库；
保障实验室间数据对比性。

十二、模板浓度校准的误差控制与统计分析

QuantStudio 5软件支持自动误差分析与统计计算：

标准偏差（SD）与变异系数（CV）

SD = √(Σ(Ct−Ct平均)² / n−1)；
CV = (SD / Ct平均) × 100%；
CV≤2%为理想。

线性回归分析

输出R²与残差分布图；
检查异常点是否显著偏离拟合线。

置信区间计算

软件可自动生成回归区间，用于评估预测浓度的可靠性。

重复性评估

不同批次实验标准曲线重合良好表示校准一致性高。

十三、模板浓度校准结果判定标准

参数	理想值	判定标准
R²	≥0.99	曲线线性良好
斜率	–3.1 ~ –3.6	扩增效率稳定
效率E	90%–110%	系统性能正常
Ct重复差	≤0.3	实验重复性佳
阴性对照	无信号	无污染

若任何指标不符合要求，应重新评估模板浓度或体系条件。

十四、模板浓度校准实例分析

以病毒定量检测为例：

制备6点标准曲线（10⁷–10² copies/μL）；
扩增程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min；
软件输出结果：

斜率 = –3.33；
R² = 0.999；
扩增效率 = 99.8%。
根据标准曲线方程 Ct = –3.33×log(C₀)+37.9，可计算未知样品浓度。
若样品Ct = 28，则C₀ = 10^{(37.9–28)/3.33} = 5.9×10³ copies/μL。

此结果表明模板浓度校准准确可靠，体系反应效率高，仪器检测稳定。

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