一、标准曲线的基本原理

标准曲线是基于PCR扩增的指数反应特性建立的数学模型。PCR反应中产物数量理论上每个循环翻倍，荧光信号与DNA产量呈正比。通过一系列已知浓度的标准模板扩增得到Ct值，并将Ct与模板浓度（以对数形式表示）进行线性回归，便可获得标准曲线方程：

Ct=k×log⁡(C0)+bCt = k \times \log(C_0) + bCt=k×log(C0)+b

其中，

• Ct 为阈值循环数；

• C₀ 为初始模板浓度；

• k 为斜率（反映扩增效率）；

• b 为截距。

标准曲线的质量由相关系数（R²）和扩增效率（E）衡量。理想情况下：

• R² ≥ 0.99，代表线性良好；

• 扩增效率E = 90%–110%，表示体系性能稳定。

二、标准曲线的实验意义

1. 绝对定量分析基础：根据标准曲线推算未知样品浓度；

2. 评估扩增体系性能：检验引物效率与反应体系是否稳定；

3. 检测仪器灵敏度：反映荧光采集与信号放大精度；

4. 实验质量控制：用于判断反应是否受到抑制或污染。

在临床检测、转基因检测及微生物定量中，标准曲线是定量准确度的核心保障。

三、实验前准备

1. 反应体系准备

QuantStudio 5适用于SYBR Green和TaqMan探针两种体系。常见反应体积为20 µL：

• 10 µL 2×Master Mix；

• 0.4 µL 上下游引物（各10 µM）；

• 1 µL 标准模板；

• 8.2 µL 无核酸水。

2. 模板制备

标准曲线模板可来自以下几种来源：

1. 已知浓度的质粒DNA；

2. 经测序验证的PCR产物；

3. 合成寡核苷酸或标准RNA。

模板需具备高纯度（A260/A280比值1.8–2.0）与明确浓度。可通过NanoDrop或荧光定量仪进行定量。

3. 梯度稀释

采用10倍或5倍梯度稀释制备系列标准溶液。
例如：10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² copies/µL。
每个稀释梯度设置三重复孔，以提高统计可靠性。

四、QuantStudio 5标准曲线制作流程

1. 软件启动与实验创建

打开QuantStudio Design & Analysis软件，选择“New Experiment”，在实验类型中选择 “Standard Curve (Absolute Quantification)”。

输入实验名称、文件保存路径与项目描述。系统将自动生成标准曲线模板结构。

2. 样品与靶标布局

• 进入 Sample Setup 界面；

• 输入标准样品名称，如“Std_1”、“Std_2”等；

• 在“Task Type”中选择 Standard；

• 填入标准品对应的浓度值（例如 10⁷–10²）；

• 未知样品选择“Unknown”；

• 设置内参基因或参考探针通道（如ROX）。

3. 光学通道配置

根据体系选择通道：

• SYBR模式使用 FAM通道；

• TaqMan探针实验使用 FAM/VIC 或多通道组合；

• 选择“Passive Reference”为ROX以进行信号归一化。

4. 热循环参数设置

推荐扩增程序如下：

• 初始变性：95℃ 2分钟；

• 扩增阶段（40循环）：

• 95℃ 15秒；

• 60℃ 1分钟（采集荧光）；

• 熔解曲线分析（若为SYBR模式）：60–95℃，升温速率0.3℃/秒。

5. 荧光信号采集

在退火/延伸阶段采集荧光信号；
采集频率：每循环一次；
选择自动阈值与基线设置，以便后续系统计算Ct值。

6. 启动实验与实时监控

点击“Start Run”，仪器进入实时扩增模式。软件显示每个循环的荧光曲线与温度状态。

五、数据分析与标准曲线生成

实验结束后，QuantStudio软件自动进入数据分析模块。

1. 扩增曲线观察

• 检查所有标准孔曲线是否平滑，S形上升无异常波动；

• 阴性对照应无荧光信号或Ct值。

2. Ct值提取

系统自动计算每孔Ct值并取平均。重复孔间Ct差应≤0.3。

3. 曲线绘制

软件自动生成 标准曲线图：

• 横坐标为模板浓度的对数（Log10）；

• 纵坐标为Ct值；

• 系统自动计算线性回归方程、R²与扩增效率。

4. 计算扩增效率

扩增效率（E）计算公式为：

E=(10−1/斜率−1)×100%E = (10^{-1/斜率} - 1) \times 100\%E=(10−1/斜率−1)×100%

理论上：

• 理想斜率为 –3.32（对应100%效率）；

• 斜率范围 –3.1 至 –3.6 表示反应正常。

5. 相关性分析

相关系数R² ≥ 0.99 表示Ct与浓度的线性关系良好。若低于0.98，需检查梯度稀释或反应体系。

六、结果评估与判断标准

1. 标准曲线直线性

• Ct值与Log浓度应呈线性分布；

• 若出现偏离，说明某梯度点扩增异常。

2. 扩增效率

• 90%–110%为合格区间；

• 效率过高（>110%）多因污染或引物二聚体；

• 效率过低（<90%）可能因引物浓度不当或反应抑制。

3. 重复性检查

• 各重复孔Ct标准差≤0.3；

• 若超出，需重新检测该梯度点。

4. 阴阳性对照验证

• 阳性对照应有正常Ct；

• 阴性对照无荧光信号。

5. 标准品浓度选择

• 覆盖目标样品的预期浓度范围；

• 浓度跨度至少4个数量级。

七、影响标准曲线质量的因素

1. 模板质量

• 污染或降解导致浓度不准；

• 纯度不够影响扩增效率。

2. 移液误差

• 稀释倍数不准确会造成曲线不线性；

• 建议使用校准移液器与低吸附吸头。

3. 扩增体系

• Mg²⁺浓度、酶活性、缓冲液离子强度均影响反应效率。

4. 温控系统

• 若孔间温差>±0.25℃，会造成Ct偏移；

• QuantStudio 5采用Peltier热循环技术以保证均一性。

5. 光学采集与阈值设置

• 阈值过高会推迟Ct，过低会提前检测；

• 建议使用软件自动模式。

八、标准曲线优化策略

1. 模板稀释精度控制

• 每步稀释使用新吸头，轻轻混匀；

• 建议采用无RNA酶水进行稀释。

2. 重复次数增加

• 每个梯度至少三重复孔；

• 异常孔位可剔除平均。

3. 标准点范围调整

• 若目标样品Ct超出曲线范围，需扩展梯度浓度。

4. 引物优化

• 设计引物长度18–22 bp，GC含量40%–60%；

• 扩增片段80–200 bp为佳。

5. 扩增条件优化

• 调整退火温度（58–62℃）筛选最佳曲线；

• 适当延长延伸时间以提高信号强度。

6. 反应体系稳定性检查

• 确认酶与缓冲液未过期；

• 若多次重复曲线偏移，应重新制备标准品。

九、数据报告与导出

QuantStudio 5软件可自动生成标准曲线报告：

1. 报告内容

• 扩增曲线、标准曲线图、Ct表格；

• 斜率、截距、R²与效率参数；

• 标准品与未知样品浓度计算结果。

2. 导出格式

• CSV、XLS、PDF、XML等；

• 可直接导入统计软件进行二次分析。

3. 数据可视化

• 软件支持多曲线叠加显示；

• 可同时对比不同批次的标准曲线稳定性。

十、标准曲线应用实例

以病毒拷贝数定量为例，标准曲线建立如下：

• 制备标准DNA溶液浓度为10⁷–10² copies/µL；

• 扩增程序按TaqMan体系设定；

• 曲线结果显示：

• 斜率 = –3.32；

• R² = 0.999；

• 扩增效率 = 100%。
  根据方程Ct = –3.32 × log(C) + 38，可推算未知样品浓度。若样品Ct为25，则其浓度约为10⁵ copies/µL。

十一、常见问题与解决方法

十二、标准曲线的长期维护与验证

1. 标准品保存

• 分装后置于–20℃保存，避免反复冻融；

• 定期验证浓度稳定性。

2. 周期性验证

• 每月重新扩增一次标准品，确保曲线线性；

• 若R²或效率偏离正常范围，应重新制备。

3. 多批次曲线对比

• 软件可叠加多次标准曲线以监控系统稳定性。

4. 仪器校准

• 每3–6个月执行一次光学校准与温度验证。