一、概述

QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪是Thermo Fisher Scientific公司推出的一款高性能定量PCR系统，具备5通道（96孔）和6通道（384孔）版本，可满足不同实验通量需求。该设备广泛应用于基因表达定量、病原体检测、基因分型、拷贝数分析、药物筛选等研究领域。

QuantStudio 5集成了精密的温控模块、光学检测系统和智能数据分析平台，支持Thermo Fisher Cloud远程管理与协同分析。通过标准化实验流程，用户可获得高灵敏度、高重复性和高可追溯性的数据结果。

二、实验前准备

1. 环境要求

• 室温控制在20–25°C，相对湿度30–70%；

• 保持实验台清洁干燥，防止粉尘和气溶胶污染；

• 实验室应分区操作：试剂准备区、样品处理区、扩增检测区分开使用；

• 仪器放置在稳固防震台上，距离墙面≥10 cm以保证通风散热。

2. 仪器检查

在开机前进行例行自检：

• 检查电源线连接可靠；

• 核对模块表面清洁、无划痕或残留液体；

• 确认上盖加热系统正常，开合顺畅；

• 检查通道校准状态（光学校准与温控校准有效期内）；

• 确保触控屏与USB接口正常工作。

3. 试剂准备

• 使用经过质量验证的Master Mix，如PowerUp SYBR Green或TaqMan Fast Advanced；

• 检查引物、探针及模板是否在有效期内；

• 所有试剂使用前应充分融化并轻轻混匀，避免剧烈震荡；

• 稀释与配制使用无核酸酶水（Nuclease-Free Water）。

4. 操作用品准备

• 使用96孔或384孔光学反应板、光学封膜；

• 采用带滤芯吸头防止气溶胶污染；

• 反应板、管、膜应为无RNA/DNA酶耗材；

• 准备低温保存架用于样品操作。

三、实验体系设计

1. 选择实验模式

QuantStudio 5支持多种实验类型，常见模式包括：

• 标准曲线（Standard Curve）：用于绝对定量；

• 相对定量（ΔΔCt）：用于基因表达比较；

• 基因分型（Genotyping）：用于等位基因区分；

• 熔解曲线分析（Melt Curve）：用于特异性验证；

• 高分辨熔解分析（HRM）：用于突变筛查。

2. 实验体系示例（20 μL反应体系）

3. 对照设置

• NTC（无模板对照）：检测污染；

• 阳性对照：验证反应体系有效性；

• 内参基因：用于归一化；

• 标准梯度样：用于绘制标准曲线。

4. 配制注意事项

• 配制反应体系前应在冰上操作；

• 先混合Master Mix与引物探针，再加入模板；

• 体系应轻轻吹打或短暂离心混匀；

• 避免气泡产生，防止光学信号干扰；

• 每批实验增加10%余量以补偿操作误差。

四、加样与装板

1. 加样步骤

1. 在PCR专用操作区完成加样；

2. 样品顺序与孔位按板设计图对应；

3. 每孔加入20 μL反应体系；

4. 加样后短暂离心（2000 rpm，30秒）以去除气泡；

5. 检查是否有漏孔或交叉污染。

2. 板封与标记

• 使用光学透明膜封板，确保密封严实；

• 压膜后轻压均匀，避免褶皱；

• 使用板架固定防止变形；

• 在板侧标记实验编号与日期。

3. 放入仪器

• 确认模块温度与板型一致（96孔或384孔）；

• 将反应板平稳放入样品槽；

• 关闭上盖，系统自动检测压力接触是否良好。

五、实验程序设置

1. 启动与登录

开机后进入主界面，选择用户账户登录。
管理员可设置不同权限（运行、分析、报告导出）。

2. 新建实验文件

选择“Create New Experiment”，根据应用类型选择模板，如：

• Standard Curve

• Relative Quantification

• Melt Curve

• Genotyping

输入实验名称与保存路径。

3. 板布局设置

在“Plate Setup”界面：

• 定义每个孔的样品名称与靶基因；

• 指定荧光通道（如FAM、VIC、ROX、Cy5）；

• 标明对照样品、内参与未知样。

4. 热循环参数设定

常规SYBR Green程序（标准模式）：

• Step 1：95°C 2分钟（初始变性）；

• Step 2：95°C 15秒，60°C 30秒，共40循环；

• Step 3：熔解曲线分析 60–95°C（升温速率0.3°C/s）。

TaqMan快速程序（Fast模式）：

• Step 1：95°C 20秒；

• Step 2：95°C 1秒，60°C 20秒，循环40次。

5. 荧光采集设置

• 选择在退火/延伸阶段进行荧光检测；

• 多通道实验需分别设定采集通道；

• 若进行熔解曲线分析，启用相应检测模式。

6. 校验与保存

核对孔位信息、循环数、采集设置，保存实验文件。

六、实验运行

1. 启动反应

点击“Start Run”，仪器将自动执行热循环程序。
屏幕显示实时扩增曲线、循环进度及剩余时间。

2. 实时监控

QuantStudio 5可实时显示每孔荧光信号变化。

• 正常扩增应呈现“S”型曲线；

• 若无信号或曲线异常，应暂停并检查体系。

3. 实验时间

标准40循环约需40–60分钟，快速模式约需30分钟。

4. 自动保存

实验结束后系统自动保存结果文件（.eds）。

七、实验结束与清理

1. 取出反应板

待模块温度降至40°C以下再取出反应板，防止热变形。

2. 清洁模块

使用无水乙醇或光学纸轻擦模块表面，去除残留物。

3. 系统关机

• 退出用户界面并保存设置；

• 关闭电源，覆盖防尘罩。

4. 实验区域清理

• 使用75%乙醇擦拭工作台；

• 废弃反应板高压灭菌后弃置；

• 加样器具紫外消毒。

八、数据分析流程

1. 文件导入

在QuantStudio Design & Analysis Software或Thermo Fisher Cloud中打开.eds文件。

2. 扩增曲线分析

• 检查曲线形态是否标准；

• NTC应无明显扩增信号；

• 重复孔Ct值差异≤0.3。

3. 阈值与基线调整

• 阈值应位于指数增长区中段；

• 基线范围一般为循环3–15；

• 重新分析后确认Ct稳定。

4. 标准曲线生成

若进行绝对定量分析，系统自动绘制Ct–log拷贝数曲线，显示R²与效率。
理想条件：R²≥0.99，效率90–110%。

5. 相对定量计算

采用ΔΔCt法计算目标基因表达倍数：

ΔCt=Ct目标−Ct内参ΔCt = Ct_{目标} - Ct_{内参}ΔCt=Ct目标−Ct内参ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照ΔΔCt = ΔCt_{样品} - ΔCt_{对照}ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照表达倍数=2−ΔΔCt表达倍数 = 2^{-ΔΔCt}表达倍数=2−ΔΔCt

6. 熔解曲线分析

• 单峰：扩增特异性好；

• 多峰：存在引物二聚体或非特异性产物；

• 可通过提高退火温度或优化引物序列改进。

7. 报告生成

导出结果为Excel或PDF格式，报告应包含：

• 实验编号、日期、操作者；

• Ct值表与标准曲线；

• 扩增与熔解曲线图；

• 扩增效率与统计结果。

九、质量控制与验证

若某项不合格，应重新评估试剂质量或操作步骤。

十、常见问题及处理

十一、维护与保养

1. 日常维护

• 每次实验后清洁温控模块与样品舱；

• 检查上盖加热表面是否平整；

• 保持设备外壳干净干燥。

2. 定期维护

• 每6个月执行光学与温控校准；

• 检查风扇与通风口是否通畅；

• 更新软件至最新版本。

3. 长期停机

• 关闭电源并拔掉插头；

• 覆盖防尘罩；

• 存放环境温度10–30°C，湿度<70%。

十二、安全与规范要求

1. 遵守生物安全实验室标准（如BSL-2）；

2. 操作含病原样品时佩戴防护手套与护目镜；

3. 废弃物分类处理，含核酸样品须高压灭菌；

4. 严禁在检测区开封扩增产物；

5. 记录每次实验操作员与时间，确保可追溯性。

十三、实验优化建议

• 使用新鲜模板并检测纯度（A260/A280 1.8–2.0）；

• 采用优化退火温度（±1°C微调）提高特异性；

• 使用相同批次试剂以降低批间差异；

• 在分析前统一阈值与基线参数；

• 对关键基因重复实验三次以验证可靠性。

十四、实验结果判断标准

相对定量中，表达倍数>2视为上调，<0.5为下调。