一、荧光信号采集的基本原理

实时荧光定量PCR（qPCR）的核心是通过荧光信号变化实时反映PCR扩增产物的数量。QuantStudio 5通过光学检测系统监测每个循环中荧光强度的变化，进而计算出扩增效率和起始模板量。

荧光信号采集的原理包括三个过程：

1. 荧光激发：LED光源发出特定波长的光，照射到含有荧光染料或探针的反应体系中；

2. 荧光发射：荧光分子吸收能量后，在特定波长范围内释放光信号；

3. 信号检测：光学滤光片和CCD相机捕获荧光强度，并转换为数字信号。

荧光信号与扩增产物的量成正比。随着反应的进行，系统在每一循环采集一次信号，从而得到荧光强度随循环数变化的扩增曲线。Ct（Cycle Threshold）值的确定依赖于荧光信号首次超过阈值线的位置，这一过程的准确性完全取决于信号采集系统的灵敏度与稳定性。

二、QuantStudio 5光学检测系统结构

QuantStudio 5配备高灵敏度多通道光学检测模块，能够实现多色荧光信号的同时采集。其光学系统主要由以下部分组成：

1. 激发光源（Excitation Light Source）

• 采用高亮度LED光源，具有寿命长、稳定性高、能耗低等特点；

• 多波长LED配置，可覆盖400–700 nm范围，满足多种荧光染料的激发需求；

• 光强稳定性误差≤2%，避免信号漂移。

2. 滤光片系统（Filter Set）

• 包括激发滤光片与发射滤光片两组，用于分离不同荧光通道；

• 每个滤光片组具有严格的光谱带宽控制，确保通道间信号独立；

• 有效防止荧光信号泄漏。

3. 光路系统（Optical Pathway）

• 光路采用固定光学设计，无需移动镜头即可实现全板检测；

• 光线经反射镜组均匀照射96孔板，确保每个孔获得相同的激发能量；

• 保证孔间荧光采集一致性。

4. 检测器（CCD Camera）

• 采用高灵敏度电荷耦合器件（CCD），可同时采集全板荧光信号；

• 动态范围宽（>6个数量级），适用于强弱信号样品；

• 内置自动曝光功能，根据荧光强度动态调整采集时间。

5. 参考光学模块（Optical Reference System）

• 内置参考光检测器，用于监测LED输出波动并自动校正；

• 提高信号稳定性和数据一致性。

三、荧光信号采集流程

QuantStudio 5在每个PCR循环中自动执行荧光信号采集，其主要步骤如下：

1. 热循环控制

• 每个循环包含变性、退火和延伸阶段；

• 在退火或延伸阶段（具体根据体系设定）进行荧光信号检测。

2. 信号激发与发射

• 系统在采集点启动LED激发光源；

• 荧光分子发射光信号，通过发射滤光片传递至CCD检测器。

3. 信号采集与处理

• CCD检测器同步采集所有孔的荧光信号；

• 系统对原始信号进行光强校正、基线扣除与信噪比计算；

• 软件生成荧光变化值ΔRn，并实时绘制扩增曲线。

4. 多通道采集

• QuantStudio 5支持多通道同步采集（FAM、VIC、ROX、CY5等）；

• 软件通过光谱解卷积算法分离不同染料的信号。

四、荧光信号采集的类型与模式

QuantStudio 5支持两种主要采集模式，分别适用于不同化学体系：

1. SYBR Green染料模式

• 荧光染料与双链DNA结合后发出信号；

• 每次循环在延伸阶段采集荧光；

• 适用于基因表达、相对定量分析及熔解曲线检测。

2. TaqMan探针模式

• 使用带有Reporter与Quencher的特异性探针；

• 扩增过程中探针被Taq酶切割，Reporter释放发出荧光；

• 信号在退火/延伸阶段采集，灵敏度与特异性高。

此外，系统还支持多重检测模式（Multiplex），可在同一反应中同时检测多个靶标，利用不同通道区分信号。

五、荧光通道配置

QuantStudio 5具有6通道光学检测能力，支持多达5色荧光同时检测。各通道参数如下：

通道可根据实验类型自定义启用。多靶标实验应选择光谱间隔大的染料组合，以降低交叉干扰。

六、信号校正与参考通道

1. 参考染料（Passive Reference）

• QuantStudio 5通常使用ROX作为参考染料；

• 它的荧光强度不随扩增变化，用于校正孔间体积误差与光学漂移。

2. 自动信号校正算法

• 软件自动将每个孔的原始荧光强度除以参考染料信号；

• 结果为ΔRn值，反映实际扩增信号变化。

3. 光学通道校准

• 定期运行系统校准程序，确保通道间增益一致；

• 校准误差应小于±2%。

七、信号灵敏度与动态范围

QuantStudio 5的荧光信号采集系统具有高灵敏度与宽动态范围：

1. 检测灵敏度：可检测到低至10个拷贝的DNA模板；

2. 动态范围：7个数量级（10¹–10⁷ copies）；

3. 线性响应性：荧光强度与产物数量呈线性关系，R²≥0.99；

4. 信噪比（SNR）：≥3，保证弱信号样品的稳定检测。

高灵敏度的CCD检测与自适应曝光算法确保低荧光样品信号仍具可识别性。

八、荧光信号采集的影响因素

荧光信号采集受多种因素影响：

1. 样品因素

• 模板浓度过低或降解；

• 探针或染料浓度不足；

• 反应体系配比不均。

2. 操作因素

• 移液误差导致体积不一致；

• 气泡影响光路；

• 封膜不严导致蒸发或污染。

3. 仪器因素

• 光学窗口污染或灰尘遮挡；

• LED光源老化；

• 温控不均引起信号漂移。

4. 软件因素

• 阈值线设置错误；

• 基线校正区间选择不当。

九、信号采集优化策略

1. 体系优化

• 模板质量应高，A260/A280比值1.8–2.0；

• 使用高纯度探针与引物，避免自聚合；

• 增加Mg²⁺浓度可增强信号强度。

2. 实验操作优化

• 混匀样品后离心，避免气泡；

• 使用光学透明反应板与专用密封膜；

• 保证样品量与反应体系一致。

3. 仪器维护优化

• 每次实验前清洁光学窗口；

• 每3个月执行光学校准；

• 避免强光照射与环境震动。

4. 软件参数优化

• 调整基线范围（3–15循环为宜）；

• 阈值线设在扩增曲线指数增长区；

• 检查重复孔Ct标准差≤0.3。

十、荧光信号数据处理流程

1. 原始数据采集：系统记录每循环的荧光强度；

2. 背景扣除：减去基线信号；

3. ΔRn计算：使用参考通道校正信号；

4. 扩增曲线生成：绘制ΔRn与循环数的关系图；

5. Ct值计算：当曲线超过阈值线时记录循环数；

6. 结果输出：生成扩增曲线图、Ct表与标准曲线分析结果。

十一、信号采集中的质量控制

QuantStudio 5提供多层级信号质量控制功能：

1. 系统自检：每次启动自动检测光源输出与CCD状态；

2. 实时监控：实验过程中实时显示荧光信号变化；

3. 重复性控制：自动计算重复孔Ct值差异；

4. 异常提示：光学信号异常会触发报警与日志记录。

在数据分析阶段，系统可自动识别异常孔位并标注排除。

十二、荧光信号采集与扩增曲线的关系

荧光信号采集质量直接决定扩增曲线的形态：

• 理想曲线：S形，基线平稳，指数上升明显，平台稳定；

• 异常曲线：基线漂移或信号噪声过大导致Ct不稳定；

• 重复孔一致性差：说明采集或体系不均，应重新校准。

通过高质量信号采集，QuantStudio 5可实现曲线重叠性好、Ct偏差小于0.25的精确检测结果。

十三、多通道信号的同步采集与光谱解卷积

QuantStudio 5采用光谱解卷积（Spectral Deconvolution）算法，实现多通道信号的同步分离。

1. 同步采集机制确保各通道时间点一致；

2. 软件根据通道滤波特性计算光谱重叠矩阵；

3. 自动扣除信号交叉干扰；

4. 保证多重PCR实验中各靶标信号的独立性。

十四、信号稳定性验证

QuantStudio 5在出厂与使用过程中均经过严格的稳定性验证：

• 温度依赖性测试：在15–30℃环境下信号偏差<2%；

• 孔间一致性：96孔间荧光偏差<±3%；

• 重复性实验：同一样品Ct标准差<0.3；

• 信号线性测试：7个数量级范围内R²≥0.99。

这些性能指标确保荧光采集的高准确性与可重复性。

十五、荧光信号采集的维护与保养

1. 清洁光学窗口：使用无尘布蘸无水乙醇擦拭；

2. 检查通风口：防止灰尘堵塞导致热不均；

3. 定期校准光学系统：使用校准板进行光源强度与通道平衡测试；

4. 避免高湿环境：防止光学组件受潮；

5. 每年进行专业维护：由授权工程师检测光学与热控模块。

十六、信号采集在不同实验类型中的应用

1. 基因表达分析：通过FAM与VIC通道检测目标与内参基因；

2. 绝对定量实验：通过标准曲线计算未知样品浓度；

3. SNP分型实验：通过FAM/VIC通道比对区分等位基因；

4. 病原体检测：多通道检测多个靶标基因，提高检测通量；

5. 熔解曲线分析：通过连续采集荧光随温度变化信号，判断特异性。

十七、常见问题与解决办法