一、概述

QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪（Real-Time PCR System）是Thermo Fisher Scientific公司研发的高性能实时PCR检测平台。其光学系统、温控模块和数据算法经过优化，能实现精确的荧光信号采集与可靠的数据处理。

在PCR实验中，定量分析的核心在于对荧光信号的动态变化进行数学建模与统计处理，从而确定扩增起点（Ct值）并计算模板浓度。QuantStudio 5配合专用的QuantStudio Design & Analysis Software或Thermo Fisher Cloud平台，可自动完成从信号采集到统计分析的全过程，提供可追溯的科学数据。

二、数据文件结构与导入

1. 文件格式

实验结束后，QuantStudio 5会自动生成原始结果文件（.eds格式），文件中包含：

• 实时荧光信号原始数据；

• 扩增曲线、温度曲线与系统参数；

• 每孔样品标识、通道设置与分析算法信息。

2. 文件导入

可通过两种方式进行分析：

• 本地分析：使用QuantStudio Design & Analysis Software打开.eds文件；

• 云端分析：上传至Thermo Fisher Cloud平台进行协同分析。

数据导入后，系统会自动进行信号平滑、基线校正与初步阈值设定。

三、扩增曲线分析

1. 扩增曲线的意义

扩增曲线（Amplification Plot）反映了PCR反应过程中荧光信号随循环次数的变化情况，是定量PCR数据分析的基础。

典型的扩增曲线可分为四个阶段：

1. 基线期（Baseline Phase）：早期循环阶段，荧光信号主要来自体系背景；

2. 指数期（Exponential Phase）：产物量呈2ⁿ倍增长，信号强度快速上升；

3. 线性期（Linear Phase）：反应组分消耗，扩增速度减缓；

4. 平台期（Plateau Phase）：体系进入饱和，荧光强度趋于稳定。

2. 理想曲线特征

• 在指数期出现陡直上升段；

• 背景噪声平稳，无明显漂移；

• NTC（无模板对照）无信号或延迟Ct>40；

• 扩增结束时平台高度一致，说明反应均衡。

3. 异常曲线类型

• 平坦曲线：模板浓度过低或酶失活；

• 抖动曲线：信号采集异常或气泡干扰；

• 提前上升曲线：污染或非特异性扩增；

• 晚期漂移曲线：反应效率下降或荧光饱和。

四、阈值与基线设定

1. 基线设定原则

基线是系统在无特异性信号阶段的平均荧光强度范围。
QuantStudio 5软件自动在循环3–15之间取平均值作为基线，可根据实验类型手动调整。

• 若曲线早期已出现上升，应适当缩短基线范围；

• 若噪声较大，可扩大基线范围以平滑曲线。

2. 阈值（Threshold）定义

阈值是荧光信号被判定为显著高于背景的水平。
系统通过计算ΔRn（Rn – 基线均值）确定荧光变化，当ΔRn首次超过阈值时的循环数即为Ct。

3. 阈值设置策略

• 阈值应位于指数上升区中段；

• 远离基线噪声上限与平台区；

• 所有样品在同一实验中应使用统一阈值。

4. 阈值类型

• 自动阈值：系统根据曲线噪声自动设置；

• 手动阈值：用户依据曲线形态自行调整，适用于低拷贝或特殊样品。

五、Ct值计算与意义

1. Ct定义

Ct（Cycle threshold）为扩增曲线信号首次超过阈值的循环数。它反映模板初始浓度的相对量，Ct值与初始模板拷贝数呈负对数关系。

2. 数学关系

Ct=log⁡(Nt/N0)log⁡(1+E)Ct = \frac{\log(N_t/N_0)}{\log(1+E)}Ct=log(1+E)log(Nt/N0)

其中：

• NtN_tNt：达到阈值时的扩增产物量；

• N0N_0N0：初始模板数量；

• $E$：扩增效率（一般为0.9–1.1）。

3. Ct值的应用

• 绝对定量：用于计算样品拷贝数；

• 相对定量：用于比较基因表达差异；

• 质量控制：用于评价样品提取和反应体系稳定性。

4. 重复性判断

同一样品三重复Ct标准差应≤0.3，否则说明加样或体系存在误差。

六、扩增效率与标准曲线分析

1. 标准曲线建立

标准曲线通过一系列已知浓度模板进行10倍稀释建立，绘制**Ct值与log(拷贝数)**的关系图。

2. 方程形式

Ct=−1log⁡(1+E)×log⁡(N0)+bCt = -\frac{1}{\log(1+E)} \times \log(N_0) + bCt=−log(1+E)1×log(N0)+b

系统自动计算线性回归方程并给出以下指标：

• 斜率（Slope）：理想值为–3.32（对应效率100%）；

• 相关系数（R²）：≥0.99说明线性良好；

• 扩增效率（E）：计算公式

E=(10−1/slope−1)×100%E = (10^{-1/slope} - 1) \times 100\%E=(10−1/slope−1)×100%

3. 效率评估

4. 异常线性原因

• 加样不均或稀释误差；

• 引物效率差异大；

• 模板质量不稳定；

• 阈值设定不合理。

七、定量分析方法

1. 绝对定量分析

原理：
依据标准曲线方程，通过Ct值计算未知样品的拷贝数。

步骤：

1. 建立标准曲线；

2. 代入未知样Ct值求对应log(拷贝数)；

3. 反算得到样品模板浓度。

注意事项：

• 标准样品浓度应覆盖待测样范围；

• 每批实验均需重新建立标准曲线以保证准确性。

2. 相对定量分析

方法：ΔΔCt法
用于比较目标基因在不同样品间的表达差异。

计算公式：

ΔCt=Ct目标−Ct内参ΔCt = Ct_{目标} - Ct_{内参}ΔCt=Ct目标−Ct内参ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照ΔΔCt = ΔCt_{样品} - ΔCt_{对照}ΔΔCt=ΔCt样品−ΔCt对照表达倍数=2−ΔΔCt表达倍数 = 2^{-ΔΔCt}表达倍数=2−ΔΔCt

要点：

• 内参基因（如GAPDH、β-actin）Ct应稳定；

• 所有样品需在同一实验条件下扩增；

• ΔΔCt法假设扩增效率相同（≈100%）。

3. 多重定量分析

在多通道实验中，QuantStudio 5可同时监测多个靶基因通道（如FAM、VIC、ROX、Cy5等）。
每个通道独立计算Ct与标准曲线，并通过软件自动匹配结果。

八、熔解曲线分析

1. 原理

适用于SYBR Green体系，用于验证扩增产物特异性。
系统在扩增结束后逐步升温（60–95°C），监测荧光随温度变化的信号。

2. 曲线特征

• 单一尖锐峰：特异性良好；

• 多峰或宽峰：非特异扩增或引物二聚体；

• 平滑基线：背景信号稳定。

3. 优化建议

• 若出现多峰，需提高退火温度或优化引物序列；

• 可通过凝胶电泳验证产物长度一致性。

九、荧光通道与信号解析

QuantStudio 5支持多达5–6个光学通道，覆盖常用荧光染料：

系统会对每个通道独立计算荧光信号并扣除交叉干扰，确保信号分离度。

十、数据可视化与报告生成

1. 数据图表

QuantStudio软件提供多种数据展示方式：

• 扩增曲线图：显示每个样品的实时荧光变化；

• 标准曲线图：展示Ct与浓度的线性关系；

• 熔解曲线图：用于产物特异性验证；

• Cluster图（基因分型）：显示等位基因分布。

2. 结果报告

报告可自定义内容，包括：

• 实验名称与日期；

• 仪器型号与软件版本；

• 样品信息与Ct值表格；

• 扩增效率、R²值、ΔΔCt结果；

• 图形化扩增与熔解曲线。

3. 导出格式

• Excel (.xls/.csv)：便于数据再分析；

• PDF：标准报告形式；

• EDS：原始文件，支持二次分析。

十一、数据质量评估与误差控制

若某项指标异常，应重新检查样品纯度、引物设计或体系配方。

十二、结果解释与应用

1. 基因表达分析

ΔΔCt结果代表相对表达倍数，>1表示上调，<1表示下调。

2. 病原体检测

通过绝对定量计算病原载量。Ct≤35为阳性，>40为阴性，介于两者间为可疑。

3. 拷贝数变异分析

根据标准样的Ct与未知样比较，计算目标基因拷贝数相对变化。

4. 药物反应与基因分型

系统可自动绘制基因分型散点图，实现等位基因鉴定。

十三、常见分析错误与处理

十四、结果验证与追溯

QuantStudio 5系统具有数据追溯功能：

• 自动记录操作时间、操作者与分析参数；

• 所有阈值、基线和计算步骤均可回溯；

• 报告中附带版本号与实验日志，符合科研与临床追溯标准。

十五、优化分析建议

1. 每次实验后保存固定阈值模板，以确保不同批次数据一致性；

2. 分析低拷贝样品时，启用“Adaptive Baseline”算法；

3. 在批量数据分析时，优先进行统一的自动归一化处理；

4. 定期备份实验数据并同步至Thermo Fisher Cloud；

5. 建立实验数据质量控制表，长期追踪Ct稳定性。