赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5参数设置
一、参数设置的总体原则
QuantStudio 5的参数设置遵循“实验类型驱动、体系匹配、光学校准与分析同步”的原则。所有参数可通过QuantStudio Design & Analysis软件进行配置，并可保存为模板用于批量实验。设置的目标是确保扩增效率在90%–110%之间、Ct值线性良好（R²≥0.99）、曲线形态标准且荧光信号稳定。
核心原则包括：
合理设计扩增程序：确保热循环条件适应所用酶体系与反应体积；
匹配荧光通道与探针类型：避免光谱重叠，提高信号区分度；
优化采集频率与时间：保证信号稳定性与灵敏度；
标准化基线与阈值设置：统一分析标准，便于数据对比；
设定正确的实验类型与样品布局：确保计算方法（ΔΔCt、标准曲线等）正确执行。
二、主要参数设置界面
QuantStudio 5的设置界面主要分为以下模块：
Experiment Properties（实验属性）
实验类型：选择相对定量（Relative Quantification）、绝对定量（Standard Curve）、熔解曲线（Melt Curve）、基因分型（Genotyping）或检测实验（Presence/Absence）；
检测化学体系：SYBR Green或TaqMan探针体系；
样品布局：定义样品、靶标、对照、标准品孔位。
Thermal Profile（热循环参数）
包含初始变性、循环扩增、熔解曲线等阶段设置；
每一步可独立设定温度、时间、循环次数及荧光采集阶段。
Optical Settings（光学参数）
设置荧光通道与检测模式；
选择采集周期与通道组合。
Analysis Settings（分析参数）
基线校正范围、阈值线位置、Ct计算模式；
扩增效率与标准曲线计算方式。
Export and Report（导出与报告）
定义输出格式、报告内容及自动分析选项。
三、热循环参数设置
1. 初始变性阶段
目的：激活热启动DNA聚合酶并完全变性模板。
常用设置：95℃ 2分钟。
若使用Fast反应体系，可缩短至95℃ 20–30秒。
2. 扩增循环阶段
扩增阶段由变性、退火和延伸三个步骤组成。
（1）变性步骤
温度：95℃；
时间：15秒；
功能：使双链DNA解链，为引物退火创造条件。
（2）退火/延伸步骤
温度：一般为58–62℃（根据引物Tm值）；
时间：30秒–1分钟；
荧光采集：建议在延伸阶段采集信号。
（3）循环次数
通常设置为40次，若模板浓度低可增至45次。
3. 熔解曲线阶段（SYBR Green体系）
起始温度：60℃；
终止温度：95℃；
升温速率：0.3℃/秒；
采集模式：连续采集荧光信号，用于分析扩增产物特异性。
四、荧光通道参数设置
QuantStudio 5具备6通道光学系统（部分机型为5通道），支持多重检测。常用荧光通道如下表：
| 通道 | 激发波长（nm） | 发射波长（nm） | 常用染料/探针 | 应用场景 |
|---|---|---|---|---|
| FAM | 470 | 520 | SYBR Green, FAM探针 | 目标基因检测 |
| VIC | 530 | 555 | VIC, HEX探针 | 内参基因或对照 |
| ROX | 575 | 610 | ROX参考染料 | 信号校正 |
| CY5 | 630 | 670 | CY5探针 | 多重PCR检测 |
| TAMRA | 555 | 580 | TAMRA探针 | 辅助检测 |
| SYTO9 | 500 | 535 | SYTO系列 | 熔解曲线分析 |
设置要点：
对于多重PCR实验，不同靶标需使用光谱间隔大的染料；
禁止两个探针使用相邻光谱（如FAM与 VIC）以防荧光泄漏；
若使用ROX作为参考通道，应在“Passive Reference”选项中启用；
每个荧光通道均可独立设定采集周期与曝光时间。
五、荧光信号采集参数
信号采集是确保Ct值准确的关键环节。
采集模式选择
SYBR模式：在延伸阶段采集；
TaqMan模式：在退火/延伸阶段采集。
采集频率
默认每个循环采集一次；
对于快速程序或多重检测，可在每2个循环采集一次以提高速度。
采集时间
通常为1–2秒；
若信号强度较弱，可延长至3秒。
采集通道同步性
多通道实验中建议同步采集，保证时间一致性。
六、样品与靶标布局参数
QuantStudio 5支持96孔布局，每个孔可定义不同样品、靶标与任务类型。
样品设置
样品名称：自定义输入；
任务类型：Unknown（未知样品）、Standard（标准品）、Positive Control、Negative Control。
靶标设置
输入目标基因名称；
指定对应通道；
设置扩增类型（SYBR或TaqMan）。
重复孔
每个样品至少设置三重复；
重复Ct值标准差≤0.3为合格。
标准品梯度
建议采用10倍递减浓度（10⁶–10² copies/μL）；
生成标准曲线用于计算扩增效率。
七、分析参数设置
1. 基线设置（Baseline）
自动模式：系统在3–15个循环内识别背景区间；
手动模式：用户可自定义起止循环数以排除异常波动；
建议保持基线稳定无明显斜率。
2. 阈值线（Threshold）
表示荧光信号从背景中显著升高的固定水平；
系统可自动设定，也可手动调整；
阈值应处于指数增长阶段中部区域，确保Ct计算准确。
3. Ct计算模式
自动计算：系统根据阈值线交点确定Ct；
手动模式：用户可指定阈值位置；
推荐统一设置以便不同实验间可比。
4. 标准曲线与效率计算
通过标准品Ct与浓度对数绘制曲线；
理论斜率为–3.32（100%效率）；
可在Analysis模块中查看R²与效率百分比。
八、熔解曲线与特异性分析
在SYBR Green实验中，熔解曲线用于判断扩增产物特异性。
起始温度：60℃；
终止温度：95℃；
升温速率：0.3℃/秒；
采集间隔：每0.2℃采集一次；
单峰表示产物特异性良好，双峰或多峰需检查引物。
九、报告与数据输出参数
报告类型
Summary Report：包含Ct、扩增曲线、标准曲线等；
Melt Curve Report：包含熔解峰分析结果；
Genotyping Report：区分不同基因型结果。
输出格式
CSV、XLS、PDF、XML；
可选择是否包含扩增曲线数据点。
自动分析选项
设置实验结束后自动生成报告与图表；
支持批量导出功能。
十、优化参数策略
退火温度优化
以引物Tm值为基准，优化范围±2℃；
通过梯度PCR筛选最佳温度。
扩增效率优化
调整引物浓度（0.1–0.5 μM）；
适当增加循环时间；
检查模板纯度。
荧光强度优化
若信号过弱，检查探针浓度与通道匹配性；
避免荧光泄漏导致信号重叠。
Ct稳定性优化
使用ROX通道作为参考；
确保反应体系体积一致；
定期校准光学系统。
十一、常见问题与解决方法
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| Ct值不稳定 | 反应体系体积不均或气泡 | 离心反应板并检查移液器精度 |
| 扩增效率过低 | 模板质量差或引物设计不佳 | 更换模板并优化引物 |
| 曲线形态异常 | 阈值线错误 | 调整基线与阈值 |
| 信号强度不均 | 光学窗口污染或通道选择错误 | 清洁窗口并检查通道配置 |
| 熔解曲线多峰 | 引物二聚体或非特异性扩增 | 调整退火温度或重设计引物 |
十二、参数模板与批量操作
QuantStudio 5允许用户保存参数模板，实现快速设置：
在设置完成后点击“Save Template”；
模板包含所有热循环、光学和分析参数；
下次新建实验时选择“Load Template”即可自动加载；
可为不同实验类型（如基因表达、病原检测）建立独立模板库。
十三、实验精度与验证
温控精度验证
使用温度验证板检测孔间温差，应≤±0.25℃。
光学一致性验证
校准不同通道光强差异，误差≤2%。
扩增线性验证
标准曲线R²≥0.99。
重复性检测
重复样Ct值标准差≤0.3。
十四、参数设置实例
以TaqMan探针法基因表达实验为例：
初始变性：95℃ 2分钟；
循环阶段：95℃ 15秒，60℃ 1分钟（采集荧光）；共40循环；
通道设置：
FAM：目标基因；
VIC：内参基因；
ROX：参考染料。
基线范围：3–15循环；
阈值线：自动设置在指数增长区；
Ct算法：自动模式。
重复孔数：3；
扩增效率：95%–105%。
