赛默飞荧光定量PCR仪QuantStudio 5操作步骤
一、概述
QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 5 Real-Time PCR System）是Thermo Fisher Scientific推出的高精度实时定量PCR检测系统，适用于基因表达分析、病原体检测、拷贝数变异研究、基因分型、熔解曲线分析等多种分子生物学应用。
与QuantStudio 3相比，QuantStudio 5拥有更高的检测灵敏度、更丰富的通道配置（可支持96孔5通道与384孔6通道版本）以及更强大的数据处理能力。该系统整合了高精度温控技术、先进的光学采集模块和云端数据管理平台，可实现快速、稳定、可追溯的核酸定量分析。
本文将从实验准备到数据输出的全过程，详细阐述QuantStudio 5的标准操作步骤和要点，帮助操作者全面掌握该设备的使用方法。
二、实验前准备
1. 仪器检查
在开机前，应完成以下检查：
仪器放置平稳，确保通风良好，距离墙壁至少10 cm；
电源线连接可靠，电压稳定在100–240V范围；
温控模块干净无划痕，无灰尘或残留液体；
上盖加热系统正常，可自由开合；
光学校准和温控校准记录在有效期内；
检查显示屏与控制按钮工作正常。
2. 实验环境要求
室温保持在20–25°C，相对湿度不超过70%；
实验区应划分为“试剂准备区”、“样品处理区”和“扩增检测区”，禁止交叉操作；
使用超净台或PCR专用工作台配制体系，防止气溶胶污染。
3. 试剂准备
确认使用的Master Mix为实时PCR专用，如PowerUp SYBR Green或TaqMan Fast Advanced；
检查引物、探针及模板储存条件是否符合要求；
所有试剂使用前应完全融化并轻轻混匀，不可剧烈振荡；
实验中使用无RNA/DNA酶水（Nuclease-free water）。
三、反应体系配置
1. 实验类型选择
根据实验目的确定检测模式：
SYBR Green体系：适合基因表达定量和熔解曲线分析；
TaqMan探针体系：适合高特异性检测和多重反应；
多重荧光检测：可同时检测多个靶基因或内参。
2. 反应体系配方（以20 μL为例）
| 组分 | 体积 (μL) | 终浓度 |
|---|---|---|
| 2× Master Mix | 10 | 1× |
| 正向引物 | 0.4 | 0.2 μM |
| 反向引物 | 0.4 | 0.2 μM |
| 探针（如适用） | 0.2 | 0.1 μM |
| 模板DNA/cDNA | 2 | 10–100 ng |
| 无核酸酶水 | 补足至20 | — |
3. 操作要点
建议先配制母液（Master Mix），再加入模板；
每次体系多配10%余量以补偿加样误差；
体系配制全程在冰上进行；
加样顺序保持一致，减少系统误差；
封膜前确保孔内无气泡，可短暂离心。
四、样品装板与封膜
使用96孔或384孔光学反应板，根据实验规模选择；
加样后用专用光学透明膜封口，确保密封严实；
贴膜后使用压膜器轻压，避免气泡；
将反应板短暂离心（1000–2000 rpm，30 秒）使液体沉底；
检查孔位对应表是否与实验设计一致；
将封膜板放置于PCR机样品槽内，轻轻放置避免震动。
五、仪器开机与登录
1. 启动仪器
按下电源键后，QuantStudio 5自动启动，系统自检完成后进入主界面。
2. 用户登录
系统支持多用户账户。输入用户名与密码登录，管理员可设定不同权限（如运行、分析、导出等）。
3. 网络连接
仪器可通过Wi-Fi或以太网连接Thermo Fisher Cloud，实现数据同步与远程监控。若在本地操作，可跳过此步骤。
六、实验程序设置
1. 新建实验文件
在主界面选择“Create New Experiment”，根据实验类型选择模板：
Standard Curve（标准曲线）
Relative Quantification（相对定量）
Genotyping（基因分型）
Melt Curve（熔解曲线）
输入实验名称、项目编号和保存路径。
2. 板布局设置
在“Plate Setup”页面定义样品类型与荧光通道：
指定每个孔的样品名称与靶基因；
选择荧光通道（如FAM、VIC、ROX、Cy5等）；
设置对照（NTC、阳性对照、内参）；
保存布局模板以供后续重复实验使用。
3. 热循环参数设定
标准模式（SYBR Green）示例：
Step 1：95°C 2分钟（初始变性）
Step 2：95°C 15秒，60°C 30秒，共40循环
Step 3：熔解曲线：60–95°C（0.3°C/s）
TaqMan模式（快速反应）：
Step 1：95°C 20秒
Step 2：95°C 1秒，60°C 20秒，共40循环
4. 信号采集设置
选择在退火/延伸阶段进行荧光采集；
对SYBR体系启用“Melting Curve”；
若多通道检测，确认每个荧光通道的采集时间。
5. 校验参数
检查孔位布局与程序是否一致；
保存程序模板。
七、运行实验
1. 启动检测
确认样品板放置正确后，关闭上盖并点击“Start Run”。
仪器自动执行热循环程序，实时采集荧光信号。
2. 实时监控
在运行界面可实时观察扩增曲线与温度曲线：
扩增曲线呈“S”型表示反应正常；
若信号平缓或异常，应暂停检测并检查体系。
3. 实验进度
QuantStudio 5会显示剩余时间与循环状态。标准40循环约需40–60分钟。
八、实验结束与数据保存
1. 自动保存
实验结束后，系统会自动保存结果文件（.eds格式）。
文件可在本地存储或上传至Thermo Fisher Cloud。
2. 取出样品板
运行结束后，待模块温度降至40°C以下再取出反应板，防止热损伤。
取出后立即废弃或冷藏保存。
3. 清洁维护
清理模块表面残留液滴；
使用无水乙醇或光学擦拭布清洁样品舱；
关闭上盖并断电待机。
九、数据分析步骤
1. 打开分析软件
在QuantStudio Design & Analysis Software中导入.eds文件，或通过Thermo Fisher Cloud在线打开。
2. 扩增曲线检查
正常曲线应具备典型指数上升段和平台期；
检查阴性对照（NTC）应无扩增信号；
若出现异常，应排查加样或污染问题。
3. 阈值与基线调整
使用自动分析模式系统设定阈值；
若基线偏移，可手动调整（通常为循环3–15）；
确保阈值线位于指数增长区中段。
4. Ct值提取
软件自动生成各样品Ct值。
重复孔Ct标准差应≤0.3；若超出范围，应重新核对操作。
5. 定量分析
绝对定量：通过标准曲线（Ct–log拷贝数）计算未知样浓度；
相对定量：采用ΔΔCt方法计算基因表达倍数；
基因分型：根据荧光通道信号聚类自动判定等位基因型。
6. 熔解曲线分析
用于SYBR体系特异性验证。单一尖锐峰说明特异扩增，多峰表示引物二聚体或非特异性扩增。
7. 报告生成
可导出为Excel或PDF报告，内容包括Ct值表、标准曲线、熔解曲线与统计数据。
十、常见问题及排查
| 问题表现 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| Ct值过大或无信号 | 模板过稀或降解 | 提高模板浓度或更换样品 |
| 曲线异常平缓 | 热循环参数错误 | 检查程序设置 |
| 阴性对照有信号 | 污染或气溶胶扩散 | 更换试剂并清洁工作台 |
| 熔解曲线多峰 | 引物设计不合理 | 优化引物或退火温度 |
| 通道信号异常 | 通道未激活或荧光漂移 | 校准光学系统 |
| 实验重复性差 | 加样不均 | 使用预混体系并确保混匀 |
十一、仪器维护与保养
1. 日常维护
每次实验后擦拭温控模块与光学盖板；
保持样品舱清洁干燥；
避免液体进入设备内部。
2. 定期维护
每6个月执行一次光学校准与温控验证；
检查上盖加热模块是否工作正常；
软件与固件保持最新版本。
3. 存放与安全
长期不使用时，关闭电源并覆盖防尘罩；
避免阳光直射、高湿或强电磁干扰环境；
定期备份实验数据。
十二、实验质量控制
每批实验设置阳性、阴性对照；
同一样品应进行三重复反应以验证一致性；
Ct值标准差≤0.3为合格；
R²≥0.99、扩增效率90–110%为标准曲线合格标准；
实验结果需经两人复核并签字记录。
十三、系统软件操作优化
使用模板管理功能保存常用实验参数；
启用数据自动备份功能，防止丢失；
利用Cloud平台进行远程监控与分析，提高效率；
软件内置“Performance Verification”功能可自动检测光学与温控模块状态。
十四、安全与规范要求
严格遵守实验室生物安全规程；
样品含有病原体时，应在二级防护环境下操作；
使用化学试剂时佩戴手套与防护眼镜；
实验后废弃物分类处理，含核酸的反应产物须高压灭菌后弃置。
